Utilización de glicerol proveniente de la industria de biodiesel como fuente de carbono para la producción de lipasas recombinantes en Pichia pastoris.

• Autores: Nelsy Loango
• Directores de la Tesis: Francisco Valero Barranco (dir. tes.), José Luis Montesinos Seguí (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2015
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Josep López Santín (presid.), Marc Carnicer Heras (secret.), Pilar Díaz Lucea (voc.)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD  TESEO 
• Resumen

  • En este trabajo se recogen los resultados obtenidos en el estudio de la producción extracelular de la lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) expresada en la levadura metilotrófica Pichia pastoris bajo el PAOX1, utilizando una estrategia de alimentación con sustratos mixtos en la etapa de inducción para cultivos semicontinuos, con el fin de evaluar la viabilidad del uso del glicerol crudo como cosustrato en la producción de la lipasa para su posterior uso en la producción enzimática de biodiesel. En primer lugar se consideró la valorización del glicerol crudo obtenido a partir de aceites vegetales naturales y reciclados en la producción de biodiesel como una fuente de carbono para el crecimiento celular y la producción de la ROL. Se concluyó que en los procesos fermentativos con P. pastoris la utilización de glicerol crudo permite el crecimiento de la levadura y además no se evidencia un efecto negativo al utilizar glicerol crudo proveniente de la producción de biodiesel, en términos de rendimiento y velocidad específica de crecimiento. El sistema de expresión de la ROL en P. pastoris utilizando el PAOX1 depende de la utilización del metanol como sustrato inductor. En este trabajo se probaron diversas estrategias de adición de sustratos mixtos en cultivos semicontinuos para evaluar la producción de la proteína recombinante bajo este sistema de expresión. En primera instancia se llevó a cabo una alimentación mixta adicionando pulsos de metanol y alimentación exponencial con un cosustrato (glicerol). En el ensayo inicial, se alimentó con metanol como única fuente utilizando pulsos de metanol. Los resultados muestran que la estrategia de adición de metanol como único sustrato cada 12 horas mediante pulsos, resulta negativo tanto para el crecimiento como para la producción del producto heterólogo. En ensayos posteriores se realizaron cultivos en semicontinuo con una estrategia de alimentación mixta utilizando dos velocidades específicas de crecimiento con adición exponencial preprogramada de glicerol (0.1 y 0.02 h-1) y pulsos de metanol a dos concentraciones (10 y 5 g/L) adicionados a diferentes periodos de tiempo (1, 2, 6, y 12 h). Al utilizar una ? de glicerol de 0.1 h-1 el consumo de metanol se ve afectado, evidenciándose una clara represión del PAOX1. La concentración de los pulsos de metanol y su frecuencia tienen una influencia significativa en la producción del producto heterólogo. Posteriormente, se realizó una alimentación manteniendo fija la concentración de metanol (1.5 y 2 g/L) y el cosustrato siguiendo una alimentación preprogramada para una velocidad específica de crecimiento constante (0.02 h-1 y 0.05 h-1), Los resultados obtenidos mostraron que la producción de ROL en P. pastoris no es comparable entre las cepas Mut+ y Muts, aunque se empleen estrategias de cultivo similares. La presencia del glicerol como cosustrato no mejora la producción, ni la velocidad específica de producción. En las últimas estrategias, se planteó la utilización de sustratos mixtos en una alimentación exponencial preprogramada de glicerol a 0.02 y 0.04 h-1 con metanol para una velocidad específica de crecimiento de 0.02 h-1, y se realizó una comparación utilizando como cosustrato sorbitol a una velocidad de crecimiento de 0.02 h-1 con metanol para la misma velocidad específica de crecimiento. Se observa que el comportamiento de la cepa con sustratos mixtos glicerol y sorbitol a nivel de rendimiento Yp/x y productividad volumétrica presenta un comportamiento parecido al reportado cuando se utiliza metanol como única fuente de carbono. Los resultados de la velocidad específica de consumo de metanol son iguales cuando se utiliza metanol como única fuente de carbono y cuando se utiliza sorbitol como cosustrato, lo que muestra que el sorbitol no ejerce acciones represoras sobre el promotor PAOX1, contrario a lo observado cuando se utiliza glicerol como cosustrato donde el consumo de metanol disminuye 2.6 veces; mostrándose que, a pesar de encontrarse en condiciones limitantes el glicerol reprime al promotor PAOX1. Al utilizar glicerol y metanol como cosustratos se observa un aumento significativo de la actividad proteolítica independientemente de la velocidad específica de crecimiento sobre glicerol, lo que no se observó al utilizar sorbitol como cosustrato. Los niveles de biomasa alcanzados en los cultivos con glicerol como cosustrato son mayores que los alcanzados con sorbitol, por lo que puede ser que haya un mayor efecto de lisis celular en los cultivos con glicerol de forma que se recuperan más contaminantes en el producto final, sobre todo en etapas avanzadas del cultivo, ocasionando una disminución en la actividad específica de la proteína recombinante.