Resumen de Nuevas aproximaciones para el estudio y terapia génica de la anemia de Fanconi
La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad de baja prevalencia caracterizada principalmente por una alta frecuencia de malformaciones congénitas, elevada predisposición al cáncer y aplasia medular, siendo ésta la principal causa de muerte de los pacientes. Los principales objetivos de este trabajo han estado dirigidos a la generación de nuevos modelos experimentales que reproduzcan la aplasia medular de los pacientes con AF y al desarrollo de nuevas terapias del fallo medular. Con objeto de desarrollar nuevos modelos de fallo medular de AF, se generó un sistema experimental basado en la interferencia del gen hFANCA en células madre hematopoyéticas humanas (hCMH) procedentes de sangre de cordón umbilical. Para ello se diseñó un vector lentiviral portador de un ARN interferente (VL:shARN) que reconoció el gen hFANCA y redujo su expresión tanto in vitro como in vivo. La transducción con este VL:shARN de células CD34 positivas procedentes de muestras de sangre de cordón umbilical de donantes sanos nos permitió generar progenitores hematopoyéticos humanos (hPHs) con fenotipo AF que fueron trasplantados en ratones inmunodeficientes. Mediante esta aproximación pudimos estudiar el comportamiento in vivo y a largo plazo de hCMH con fenotipo AF. Este modelo también nos facilitó la validación, tanto in vitro como in vivo de la eficacia terapéutica de vectores lentivirales que restauraban la expresión del gen FANCA. En segundo lugar y con el objetivo de investigar nuevas terapias para pacientes con AF diseñamos una aproximación basada en la generación de hPHs tras la reprogramación de fibroblastos de pacientes AF-A corregidos mediante técnicas de edición génica. Para ello, se construyó un vector lentiviral no integrativo con secuencias de homología de un locus del genoma humano previamente definido como un sito seguro del genoma, el locus AAVS1. Los fibroblastos de pacientes con AF se transdujeron con este vector junto con un vector que expresaba ZFN nucleasas dirigidas al mismo locus, para así facilitar la integración por recombinación homóloga (RH) del gen FANCA en el locus AAVS1. La integración específica de una única copia de este gen en el genoma de las células transducidas posibilitó la corrección del fenotipo AF de las células de los pacientes. Una vez corregido el fenotipo de los fibroblastos AF-A, se reprogramaron a células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) con un vector lentiviral que expresaba los cuatro factores de reprogramación descritos por el Dr. Yamanaka. Las iPSCs con fenotipo corregido se rediferenciaron para generar progenitores hematopoyéticos en los que se validó la reversión del fenotipo de AF. En conclusión, a lo largo de esta tesis se presenta el desarrollo de un modelo humanizado de AF que podrá ser utilizado para estudiar la eficacia y seguridad de diferentes terapias con capacidad de prevenir y tratar la aplasia medular característica de la AF. Además se ha demostrado, como prueba de concepto, el desarrollo de una novedosa aproximación terapéutica para la AF basada en la generación de PHs corregidos para el defecto genético a partir de técnicas de edición génica y reprogramación celular.
