Strategies for improving production levels of HIV-1 VLPs by transient transfection of HEK 293 suspension cultures

• Autores: Laura Cervera Gracia
• Directores de la Tesis: María de las Mercedes Segura Gally (dir. tes.), Francesc Gòdia Casablancas (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2015
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Villaverde Corrales (presid.), Paula Alves (secret.), Yvonne Genzel (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
      • Cultivo celular
    • Inmunología
      • Vacunas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TESEO  DDD 
• Resumen

  • Les partícules similars a virus (VLP) ofereixen un gran potencial com a candidates per a la nova producció de vacunes. En aquest treball es presenta el desenvolupament i l'optimització d'un protocol de producció de VLP de Gag d’VIH-1 mitjançant l'expressió gènica transitòria en cultius de cèl·lules HEK 293 en suspensió. La transfecció transitòria permet una generació ràpida de proteïnes recombinants en quantitat i qualitat suficient per realitzar assajos preclínics, i és particularment interessant en les fases primerenques del desenvolupament. Aquest treball es divideix en quatre capítols principals. Al primer capítol, el medi comercial lliure de sèrum Freestyle 293 s'optimitza mitjançant l'ús de components d'origen no animal. L'ús de medis químicament definits i sense components derivats d'animals és un requisit bàsic per una vacuna destinada als éssers humans. La densitat cel·lular màxima assolida utilitzant el medi de cultiu optimitzat (suplementat amb 0,9X de mescla de lípids, 19,8 mg/L d’insulina recombinant i 1,6 mg/L de transferrina recombinant) és 5,4×106 cèl·lules/ml en discontinu, gairebé el doble del que s’assoleix utilitzant el medi sense suplementar (2.9×106 cèl·lules / ml). A més a més, després de l'optimització del medi, també s'ha millorat el protocol de transfecció. La millor producció s’aconsegueix quan les cèl·lules es transfecten a la meitat de la fase logarítmica (2-3 x 106 cèl·lules/ml) amb recanvi de medi en el moment de la transfecció utilitzant 1 g/(ml de cultiu) d'ADN i 2 g/(mL de cultiu) de polietilenimina. Mitjançant l'ús d'aquest protocol, els títols de VLP es van incrementar 2,4 vegades, obtenint 2,7 × 109 VLP/ml. Tant el medi de cultiu optimitzat com el protocol de transfecció s'utilitzen a la resta del treball. Al capítol dos, la cinètica del procés de transfecció transitòria s'estudia amb l'objectiu de caracteritzar i comprendre el procés complet a nivell intracel·lular que condueix a la producció de VLP, per tal de determinar els punts importants per poder millorar el procés. Els poliplexes comencen a interactuar amb la membrana cel·lular just després de la seva addició al cultiu. Després d’una hora i mitja es detecten al citoplasma de les cèl·lules i arriben al nucli al voltant de 4 hores després de la transfecció. Després de 10 hores es pot detectar la fluorescència GFP dins de les cèl·lules, però no s'observa la sortida de les VLPs de les cèl·lules, per gemmació, fins 48 hores després de la transfecció. El moment òptim de recollida del producte s’ha fixat a les 72 hores post transfecció ja que la producció de VLPs és màxima mentre es manté una viabilitat del cultiu alta. Al capítol 3, s'estudia la millora de la producció de VLPs utilitzant compostos específics. Es proven dos grups de potenciadors de la transfecció, un grup utilitzat per facilitar l'entrada de complexes de ADN/PEI a la cèl·lula o al nucli i un altre grup seleccionat per augmentar els nivells d'expressió gènica. Entre els vuit additius utilitzats (tricostatina A, àcid valproic, butirat de sodi, DMSO, acetat de liti, cafeïna, hidroxiurea i Nocodazol) s’identifica una combinació òptima que permet obtenir el màxim d’expressió. L'addició de 20 mM d’acetat de liti, 3,36 mM d’acid valproic i 5,04 mM de cafeina augmenta els nivells de producció 4 vegades, mentre la viabilitat del cultiu es manté al 94%. Atès que l'expressió transitòria (TGE) es basa en l'expressió episomal d'ADN plàsmidic, està limitada a un període curt de producció, d’en general unes 96 h, fet que limita la productivitat. Al capítol 4, es desenvolupa un protocol nou, anomenat expressió gènica extesa (EGE). L'objectiu de l’EGE és perllongar el període de producció, combinant el recanvi de medi i la transfecció repetida del cultiu per millorar la producció de proteïnes. L'avantatge d'aquesta metodologia és avaluada per a la producció de tres productes recombinants model: la GFP intracel·lular, la GFP secretada, i una partícula similar a virus Gag-GFP (VLP). Utilitzant aquesta nova estratègia EGE, el període de producció es perllonga entre 192 i 240 h amb un augment de producció d’entre 4-12 vegades en els nivells de producció, depenent del tipus de producte considerat.