New targets in plant boron deficiency response Nglycosylation and regulation of root developement
- Autores: Isidro Abreu Sánchez
- Directores de la Tesis: Ildefonso Bonilla Mangas (dir. tes.), Luis Bolaños Rosa (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2016
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Heiner Goldbach (presid.), Cristina Ortega Villasante (secret.), G. Patrick Bienert (voc.), Maria Reguera Blazquez (voc.), Javier Abadia Bayona (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
- Resumen
- español
Desde que Warington describiera en el año 1923 la esencialidad del boro en plantas, numerosos autores han tratado de esclarecer la función del micronutriente, los mecanismos de adquisición y las respuestas que acompañan la ausencia del micronutriente. Los primeros estudios en la nutrición del boro se centraron en las consecuencias de la deficiencia de boro sobre distintos procesos fisiológicos y rutas bioquímicas: desde la inhibición del crecimiento, transporte de agua, al metabolismo de azúcares y nucleótidos. A continuación diversos estudios llevaron a la identificación de las pectinas, y en concreto el rhamnogalacturonano II (RGII), como el ligando de boro más relevante, donde el micronutriente mediaría la dimerización del RGII, regulando así la porosidad y la rigidez de la pared celular. Otros complejos se han identificado in vivo en plantas, por ejemplo los complejos B-manitol y B-sorbitol, en plantas que producen estos polioles como azúcar móvil (en vez de la sacarosa). A posteriori, se analizó el transporte de boro usando abordajes moleculares, que llevaron a la descripción del gen BOR1 para la carga xilemática, y unos años más tarde la descripción de NIP5;1 como un importador de boro. Estos artículos supusieron una descripción sorprendente, porque durante muchos años se asumió que el boro, por ser una molécula neutra, podría atravesar la membrana lipídica sin la necesidad de canales ni transportadores. Desde entonces, se ha puesto el foco en clarificar las rutas de señalización que gobiernan la respuesta de las plantas a la deficiencia de boro, que implica tanto la fina regulación de los transportadores de boro como cambios en el transcriptoma, el proteoma y el metabolismo.
Sin embargo, muchas cuestiones sobre la deficiencia de boro siguen sin respuesta. Por ejemplo, durante muchos años se ha asumido que la dimerización del RGII ocurre in muro. Sin embargo, varios trabajos recientemente publicados parecen refutar esa hipótesis. Hasta la fecha tampoco hay una conexión evidente entre el papel del boro en la dimerización del RGII y los síntomas pleiotrópicos que se producen en deficiencia de boro. Ante estas lagunas, varios autores han propuesto la existencia de otros ligandos de boro, que podrían llenar ese hueco entre la función del boro y los síntomas producidos en su ausencia. Recientemente se ha confirmado la existencia de complejos entre el boro y glicolípidos y esfingolípidos, y en esa línea nuestro grupo se ha centrado ahora en las glicoproteínas como potenciales ligandos de boro. Las glicoproteínas son candidatos interesantes porque estructuralmente presenta los grupos cis-diol capaces de reaccionar con ácido bórico/borato, porque biológicamente realizan funciones tanto estructurales como de señalización, y porque se ha observado un mayor requerimiento de boro en procesos biológicos que acarrean un incremento en la síntesis de glicoproteínas (como la simbiosis entre rizobios y leguminosas o el desarrollo del pez zebra).
En el presente trabajo se ha analizado el potencial de las N-glicoproteínas como ligandos de boro en la simbiosis rizobio-leguminosas, hallando que algunas proteínas podrían interaccionar con el micronutriente. Sin embargo, durante el desarrollo de estos experimentos se observó una extraordinaria acumulación de N-glicoproteínas bajo condiciones deficientes de boro. Esta acumulación de N-glicoproteínas podría explicarse por fallos en la glicosilación o en la maquinaria de secreción. Dado nuestro conocimiento limitado sobre la síntesis de glicoproteínas y sobre los mecanismos de secreción de éstas en la simbiosis, y dada la complejidad añadida de trabajar en la misma, donde los dos simbiontes regulan la organogénesis del nódulo, se decidió cambiar a una planta modelo mejor caracterizada como Arabidopsis thaliana. Esta planta había sido utilizada previamente para analizar el transporte de boro, que llevó al descubrimiento de los transportadores de boro BOR1 y NIP5;1. Sin embargo, no se caracterizaron en profundidad ni los requerimientos de boro de esta planta, ni las respuestas a la deficiencia del micronutriente. En ese sentido comencé ese apartado caracterizando los síntomas que siguen a deficiencia de boro, que incluyen la inhibición del crecimiento y cambios en la morfología de la raíz. En concreto, la inhibición del crecimiento se debe a una menor elongación celular así como a un cese en la división celular, acompañadas de una diferenciación celular en regiones más próximas al ápice de la raíz, y a la desaparición del centro quiescente. Paralelos a esta reorganización del meristemo se produce la acumulación de callosa y lignina en plantas crecidas en deficiencia de boro, así como la acumulación de N-glicoproteínas. Pese a esa acumulación de N-glicoproteínas en condiciones deficientes en el micronutriente, la síntesis de N-glicoproteínas no se ve afectada, por lo que esta acumulación parece responder a un fallo en el sistema de endomembranas, como así lo apoyan una serie de ensayos preliminares con ciertos inhibidores del tráfico vesicular.
Recientemente se ha descrito en plantas otros ligandos además del RGII, y poseemos las herramientas para encontrar más en el futuro. Por ejemplo, como se deriva de este trabajo, las N-glicoproteínas son potenciales candidatos, que al estar conservado en eucariotas podrían explicar el requerimiento de boro en otros organismos que no poseen RGII. Al mismo tiempo, basados en nuestros resultados, y en las recientes publicaciones sobre la deficiencia de boro, la síntesis del RGII, los mecanismos de percepción de la integridad de la pared celular y el desarrollo de la raíz, estamos en disposición de poder explicar todos la respuesta de las plantas a la deficiencia de boro en base a un descenso en el dímero de RGII mediado por boro (dRGII-B) que sería la señal que activaría diversas rutas de señalización que explicarían muchos (si no todos) los síntomas observados en la deficiencia de boro. Las rutas de señalización serían: a) Etileno, que controlaría la elongación celular y el fenotipo “peludo” de la raíz; b) La percepción por herida/daño en la pared celular - que incluiría ácido jasmónico, ácido salicílico, especies reactivas de oxígeno (ROS) y Ca2+ – y que controlaría los depósitos de lignina y callosa, así como la expresión de ciertos genes relacionados con estrés; c) El control del tamaño del meristemo y su organización en base al balance entre auxinas y citoquininas; d) Otros mecanismos regularían la abundancia y localización de los transportadores de boro u otros fenotipos desconocidos por el momento. En mi opinión la acumulación de glicoproteínas se debe a un fallo mecánico en el sistema de endomembranas donde el micronutriente jugaría un papel primario. Futuros trabajos confirmaran, modificarán o desmentirán el modelo aquí propuesto, pero en cualquier caso permitirán definir en detalle una línea temporal de la respuestas a la deficiencia de boro que servirá para definir futuros objetivos para la mejora biotecnológica de cultivos de interés agronómico.
- English
Since Warington described in 1923 for first time boron (B) essentiality in plants, many authors have tried to understand what the micronutrient is doing, how the micronutrient is acquired, and what happens when the micronutrient is absent. First studies on B nutrition focused on physiological processes and biochemical pathways which appeared altered as a consequence of B deficiency/deprivation: from growth arrest, to transport of several solutes, and phenol, sugar or nucleotide metabolism. Next, several studies identified Rhamnogalacturonan II (RGII) pectin as the most relevant B ligand, because the micronutrient would mediate RGII dimerization and hence regulate cell wall porosity and strength. Other B complexes were identified in vivo, for example B-mannitol and B-sorbitol, in plants which produces such polyols instead of sucrose for sugar transport. Then molecular studies approached B transport, with the description of BOR1 as a gene required for B transport, and some years later also with the description of NIP5;1 . Such description was surprising because during many years it was assumed that boric acid, a neutral molecule, should not require neither channels nor carriers to move through the lipid bilayer. Since then, main efforts are focused on clarifying signaling pathways governing B deficiency response, which implies both the tight regulation of B transporters as well as the changes in transcriptome, proteome and metabolism.
However, many questions about B deficiency still remain unsolved. For example, during many years RGII dimerization was assumed to occur in muro, however recent evidences seems to reject such assumption. Also, to date there is no a convincing link between B-mediated RGII dimerization and the pleiotropic responses observed when the micronutrient is absent. Some authors argue for the existence of other B ligands, which could link B function with the observed B-deficient phenotypes. In such way, some recent reports confirmed the existence of complexes between B and polar glycolipids and glycosphingolipids. In this context our group have focused on glycoproteins because they can present cis-diols able to react with borate/boric acid at the same time that could be exerting a structural or signaling function due to complexion with B. Also some indirect evidences suggested a high requirement of B in biological processes which implies a high synthesis of glycoproteins like the symbiosis between rhizobia and legumes, or the development of zebrafish.
In the present work I have first analyzed the potential of N-glycoproteins as B ligands in rhizobia-legume symbiosis, finding some proteins which could potentially interact with the micronutrient. However, during the development of such experiments was found an unexpected hyper-accumulation of N-glycoproteins under B deficient conditions. This process could be explained by either a failure in glycosylation or due to defects in secretion and sorting. Due to the lack of knowledge about N-glycosylation and protein secretion in rhizobia-legume symbiosis, and the difficulties to work with a complex process of organogenesis regulated by plant and bacteria mechanisms, I decided to switch to a best characterized model plant as Arabidopsis thaliana. Although some previous work were done with Arabidopsis (B transporters were primarily describe here), B deficiency response in Arabidopsis was only partially characterized. Therefore, I started characterizing B deficiency symptoms, which included growth arrest and changes in root morphology. Those are product of a reduced cell elongation, a diminution of cell division, both concomitant with an early cell differentiation prolonged close to the root tip, and finally the disappearance of quiescent center. In parallel was observed an accumulation of callose and lignin substances in B deficient plants. Then was confirmed that B deficiency led to an accumulation of N-glycoproteins in Arabidopsis, similar to that described in B deficient nodules. Because B deficiency produce an accumulation of N-glycoproteins, but apparently does not alter the N-glycosylation process, the accumulation should be caused by an alteration of the endomembrane system, as supported by some drugs which inhibits endomembrane trafficking.
Nowadays has been found in plants other B ligands tan RGII, and we have the tools to find more in future. In example, N-glycoproteins are potential candidates, which could be universal B ligand in all eukaryotes and explain the requirement of B in organisms lacking RGII. But at the same time, taken together my results and most recent publications on B deficiency, RGII synthesis, cell wall perception, and root development, we have never so close to explain plant B deficiency response through a decrease of dRGII-B (B-mediated dimeric RGII) which would act as signal and trigger the activation of several signaling pathways which could explain many (if not all) phenotypes observed in response to B deficiency. Those signaling pathways activated would be: a) ethylene potentially controlling cell elongation and hairy phenotype; b) Wound/Cell Wall Damage/Pathogen-like response (involving jasmonic acid, salicylic acid, reactive oxygen species and Ca2+) which would control the accumulation of lignin and callose, as well the induction of stress responsive genes as jasmonic acid; c) control of root meristem size and root organization due to the auxin/cytokinin balance; d) unknown signaling pathways would control B transporters. By contrast, the accumulation of N-glycoproteins is in my opinion a mechanical consequence of defects on endomembrane trafficking, where the micronutrient would play a primary role. Future research will test the proposed model, and will define a fine roadmap of the B deficiency response, which will land in biotechnological targets to improve crops.
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