Sistemas de adquisición de hierro mediados por sideróforos en Herbaspirillum seropedicae Z67
- Autores: Federico Rosconi Hill
- Directores de la Tesis: Elena Fabiano (tut. tes.), Alicia Arias (tut. tes.)
- Lectura: En la Universidad de la República (Uruguay) ( Uruguay ) en 2013
- Idioma: español
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
- Resumen
Las bacterias endófitas colonizan los tejidos internos de las plantas sin causar signos externos de infección o un efecto negativo en su hospedero. Los requisitos para considerar una bacteria como endófito verdadero son la evidencia microscópica de la colonización interna de la planta y la capacidad de re-infectar las plantas hospederas. Este grupo de bacterias presentan un gran interés biotecnológico ya que pueden producir compuestos con usos medicinales e industriales, mejorar la fitorremediación, contribuir a la fertilidad del suelo y promover el crecimiento de las plantas.
Teniendo en cuenta las 300.000 especies de plantas que existen en la tierra y que cada planta es sede de una o más bacterias endófitas, la oportunidad de encontrar microorganismos nuevos y beneficiosos es considerable.
Herbaspirillum seropedicae es un endófito verdadero perteneciente al grupo de las β- Proteobacteria, subclase que incluye muchos géneros de bacterias asociados a plantas (Azoarcus, Burkholderia o Ralstonia). Coloniza y sobrevive dentro de varias gramíneas de importancia agroeconómica como arroz, sorgo, trigo, maíz y caña de azúcar. Es un organismo capaz de fijar nitrógeno atmosférico y se ha demostrado que los genes que codifican para la nitrogenasa, la enzima responsable de fijación de nitrógeno, se expresan dentro de la planta colonizada. Estudios de promoción del crecimiento en arroz y caña de azúcar demostraron que existe un incremento significativo en la biomasa total de plantas inoculadas con estas cepas. Los genomas de las cepas H. seropedicae SmR1 y Z67 están secuenciados y sólo se diferencian entre ellos por polimorfismos de base simple.
Las bacterias endófitas colonizan los tejidos internos de las plantas sin causar signos externos de infección o un efecto negativo en su hospedero. Los requisitos para considerar una bacteria como endófito verdadero son la evidencia microscópica de la colonización interna de la planta y la capacidad de re-infectar las plantas hospederas. Este grupo de bacterias presentan un gran interés biotecnológico ya que pueden producir compuestos con usos medicinales e industriales, mejorar la fitorremediación, contribuir a la fertilidad del suelo y promover el crecimiento de las plantas.
Teniendo en cuenta las 300.000 especies de plantas que existen en la tierra y que cada planta es sede de una o más bacterias endófitas, la oportunidad de encontrar microorganismos nuevos y beneficiosos es considerable.
Herbaspirillum seropedicae es un endófito verdadero perteneciente al grupo de las β- Proteobacteria, subclase que incluye muchos géneros de bacterias asociados a plantas (Azoarcus, Burkholderia o Ralstonia). Coloniza y sobrevive dentro de varias gramíneas de importancia agroeconómica como arroz, sorgo, trigo, maíz y caña de azúcar. Es un organismo capaz de fijar nitrógeno atmosférico y se ha demostrado que los genes que codifican para la nitrogenasa, la enzima responsable de fijación de nitrógeno, se expresan dentro de la planta colonizada. Estudios de promoción del crecimiento en arroz y caña de azúcar demostraron que existe un incremento significativo en la biomasa total de plantas inoculadas con estas cepas. Los genomas de las cepas H. seropedicae SmR1 y Z67 están secuenciados y sólo se diferencian entre ellos por polimorfismos de base simple.
A partir de una librería de mutantes derivados de la cepa H. seropedicae Z67 obtenidos por transposición, se buscaron e identificaron aquellos afectados en la producción o internalización de sideróforos. Las secuencias interrumpidas de dichos mutantes presentaron homología con genes codificantes para proteínas relacionadas con el transporte y biosíntesis de sideróforos, para enzimas de las rutas biosintéticas de aminoácidos, para enzimas relacionadas al metabolismo del carbono y para proteínas reguladoras y transportadoras. La capacidad de fijación de nitrógeno atmosférico fue ensayada en varias de las mutantes. La mutante H. seropedicae 44.46 posee el gen Hsero_0689 interrumpido, el cual codifica para la proteína ExbD. Este gen es inducido en respuesta a la limitación de hierro y la mutante resultó incapaz de fijar nitrógeno en medios con baja disponibilidad del metal. La mutante H. seropedicae 25.40, con el gen Hsero_3924 interrumpido, codificante para la subunidad mayor de la glutamato sintetasa, es auxótrofa para glutamato y fue incapaz de fijar nitrógeno en todas las condiciones estudiadas.
En este trabajo se analizó la respuesta de H. seropedicae Z67 a la deficiencia de hierro en condiciones de fijación de nitrógeno. Cuando existe limitación de hierro, como ocurre en la mutante 44.46, la actividad nitrogenasa se pierde totalmente. Además, se demostró que la expresión de los genes estructurales de la nitrogenasa, nifHDK, en el contexto genético de H.
seropedicae, es máxima únicamente en condiciones ricas en hierro, mientras que se ve severamente reprimida cuando la disponibilidad del metal es limitada. En esas condiciones la expresión del gen nifA, que codifica para el activador transcripcional de los genes nif, incluidos nifHDK, se reduce a la mitad .
Dada la importancia de los sistemas de adquisición de hierro para la fijación de nitrógeno, se propuso el objetivo de identificar y caracterizar los sideróforos producidos por esta bacteria. Un clon, obtenido en la misma librería de mutantes resultó incapaz de producir sideróforos. Dicha mutante tenía insertado el minitransposón en un sintetasa de péptidos no ribosomales (NRPSintetasa).
La estructura química del sideróforo se predijo usando herramientas genómicas computacionales. La estructura predicha se confirmó por análisis químico. Se encontró que los sideróforos producidos por H. seropedicae Z67 son un conjunto de lipopéptidos anfifílicos, las serobactinas A, B y C, que varían según la longitud de la cadena de ácido graso. Se demostró además la actividad biológica de las serobactinas como fuentes nutricionales de hierro para H.
seropedicae, siendo los primeros sideróforos caracterizados estructuralmente, producidos por bacterias endófitas.
Otro objetivo de esta tesis fue realizar estudios funcionales en genes implicados en el transporte y regulación de la producción de serobactinas. Mediante técnicas puestas a punto a lo largo del doctorado se obtuvieron mutantes dirigidos derivados de la cepa Z67, con los cuáles se logró identificar el receptor específico del complejo Fe3+-serobactina (Hsero_2345), el papel regulador de un factor sigma de función extracelular (Hsero_2338) y el papel modulador de la expresión de sideróforos de un transductor TonB-dependiente (Hsero_2337) no implicado en el transporte de las moléculas. A partir de estos resultados se propone un modelo de transporte y regulación a medio camino entre el descrito para los sideróforos pioverdinas producidos por cepas de Pseudomonas y el propuesto para los sideróforos ornibactinas producidos por cepas de Burkholderia.
