Papel del sistema Keap1/Nrf2 en hepatocitos durante el desarrollo de la enfermedad hepática

• Autores: Laura Morán Blanco
• Directores de la Tesis: Francisco Javier Cubero Palero (dir. tes.), Beatriz Salinas Rodríguez (dir. tes.), Yulia Nevzorova Chujina (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2023
• Idioma: español
• Número de páginas: 195
• Tribunal Calificador de la Tesis: Aranzazu Sanchez Muñoz (presid.), Maria Magdalena Leiva Arjona (secret.), Francisco Javier Vaquero Martin (voc.), Bruno Ramos Molina (voc.), Mariia Lunova (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Investigación Biomédica por la Universidad Complutense de Madrid
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Inmunología
  • Ciencias médicas
    • Patología
      • Patología experimental
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen
  • español

    El estrés oxidativo es uno de los mecanismos fisiopatológicos producidos durante el desarrollo de la enfermedad hepática aguda y crónica. El sistema Kelch-like ECHassociated protein-1 (Keap1) /Erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) mantiene el balance redox en la célula. En el presente trabajo, nuestro objetivo fue determinar la relevancia del sistema Keap1/Nrf2 en la enfermedad hepática aguda y crónica. Se utilizaron biopsias de hígado de pacientes sometidos a trasplante hepático debido a una sobredosis de paracetamol. Así mismo, se utilizaron biopsias de hígado de dos cohortes diferentes de pacientes con la enfermedad de hígado graso no alcohólico (EHGNA) con y sin fibrosis hepática. Por un lado, se emplearon ratones wild-type (WT) tanto machos como hembras de entre 8 y 13 semanas de edad, los cuales fueron tratados con una inyección intraperitoneal de paracetamol [0, 75, 150, 300 y 500 mg/kg] durante 24 h. Adicionalmente, ratones WT macho y hembra fueron alimentados con dieta normal (controles), dieta occidental, etanol 10% (EtOH) y dieta DUAL basada en la combinación de WD y el consumo de alcohol durante 23 semanas. Asimismo, se administraron a ratones WT dosis repetidas de tetracloruro de carbono (CCl4) [0,6 ml/kg] durante 28 días. Por otro lado, ratones con una deleción específica de Keap1 en hepatocitos (Keap1 hepa) fueron tratados con una única dosis de paracetamol [500 mg/kg] por medio de una inyección intraperitoneal, siendo sacrificados 6 h después de la inyección. Adicionalmente, ratones Keap1 hepa fueron sometidos a la administración de la dieta DUAL durante 23 semanas. Finalmente, los ratones fueron tratados con repetidas dosis de CCl4 [0,6 ml/kg] a diferentes tiempos (0-28 días). En todos los experimentos se utilizaron ratones Keap1fx/fx como control. Una vez sacrificados, se extrajo sangre y tejido para su posterior análisis histopatológico, proteico y transcriptómico. Por último, se aislaron hepatocitos primarios de ratones Keap1fx/fx y Keap1Deltahepa. Los hepatocitos fueron tratados con paracetamol [10 mM] durante 24 h. Además, células Alexander transfectadas con siKeap1 fueron tratadas con paracetamol [10 mM] y ácido palmítico [20 M] durante 24 y 48 h, respectivamente. La proteína Nrf2 se encuentra sobreexpresada en pacientes con fallo hepático agudo, así como en pacientes con EHGNA con inflamación hepática y fibrosis. Además, los modelos preclínicos de uso de paracetamol, dieta DUAL y de inducción de fibrosis hepática por medio de CCl4 revelaron que la proteína NRF2 y sus genes diana están expresados de manera significativa en modelos preclínicos. Los ratones Keap1Deltahepa mostraron un aumento significativo en el daño hepático analizado a través de un aumento de los niveles de transaminasas en sangre (AST y ALT), además de un incremento en muerte celular tras el tratamiento con paracetamol. De manera interesante, se observó que los ratones Keap1 hepa presentaban una disminución significativa en esteatosis hepática (triglicéridos intrahepáticos, Oil Red O) provocada por una reducción en la lipogénesis después de su tratamiento con dieta DUAL durante 23 semanas. Asimismo, los ratones Keap1 hepa revelaron un aumento significativo en el daño hepático (% de área necrótica, AST y ALT), muerte celular (TUNEL), inflamación hepática (CD45, CD11b y F4/80) y fibrosis hepática (Rojo de Sirio, colágeno Ia1, sma) tras el uso de CCl4. El silenciamiento de Keap1 en la línea celular Alexander reveló la existencia de cambios estructurales en las mitocondrias junto con un aumento de la proteína DRP1 seguido de la hiperpolarización del potencial de membrana mitocondrial. El sistema Keap1/Nrf2 podría ser un buen marcador teranóstico de la progresión de la enfermedad hepática tanto aguda como crónica.

  • English

    Oxidative stress is one of the pathophysiological mechanisms triggered in the development of acute and chronic liver disease (CLD). The Kelch-like ECH associated protein-1 (Keap1)/Erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) system is of particular importance in redox homeostasis. Therefore, in the present study, we aimed to unveil the relevance of Keap1/Nrf2 system during the progression of acute and chronic liver disease. Methods. Liver biopsies were used from human patients underwent liver transplant due to a cetaminophen (APAP) overdose. In addition, liver biopsies from two different cohorts of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) with and without liver fibrosiswere used. On one hand, 8–13-week-old male and female wild-type (WT) mice were treated with an intraperitoneal injection of APAP [0, 75, 150, 300 and 500 mg/kg] for 24 h. Furthermore, WT male and female mice were fed with Chow Diet (Control), Western Diet (WD), Ethanol 10% (EtOH) and DUAL diet for 23 weeks. Moreover, WT mice were challenged with repeated intraperitoneal injections of CCl4 [0,6ml/kg] for 28 days.In parallel, mice with hepatocyte-specific deletion of Keap1 (Keap1Δhepa) were challenged with a single intraperitoneal injection of APAP [500mg/kg] and sacrificed 6 h later. Additionally, the administration of DUAL diet was performed for23 weeks. Finally, mice were challenged with repeated doses of CCl4 [0,6ml/kg] at different time points (0-28 days). In all the experiments, Keap1fx/fx mice were used as control mice. After sacrificed, blood and tissue were collected for histopathological examination, protein evaluation and transcriptomic analysis. Lastly, Alexander cells were transfected with siKeap1 and treated with APAP[10mM] and Palmitic acid (P.A) [20μM] for 24 and 48 h respectively...