Metagenómica funcional en el acuífero de Yucatán para la búsqueda de proteasas novedosas

• Autores: Max Mizraím Apolinar Hernández
• Directores de la Tesis: Ingrid Aileen O'Connor Sánchez (dir. tes.), Yuri Jorge Jesus Peña Ramirez (dir. tes.)
• Lectura: En la Centro de Investigación Científica de Yucatán ( México ) en 2016
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: cicy.repositorioinstitucional.mx
• Resumen
  • español

    Las proteasas (sinonimo de peptidasas) (EC 3.4) son enzimas hidrolíticas que catalizan la ruptura de enlaces peptidicos de otras proteinas y en algunos casos tienen incluso la capacidad de auto hidrolizarse. Se utilizan para una amplia gama de aplicaciones biotecnologicas, especialmente en las industrias de detergentes, alimentos y productos farmaceuticos. En este estudio se construyo una biblioteca metagenomica de fosmidos a partir de biomasa procariota de agua subterranea del Acuifero de Yucatan. Se obtuvieron aproximadamente 250,000 clonas con insertos de ~35,000 pb. Se llevo a cabo un escrutinio funcional de 21,000 de estas clonas, para identificar aquellas que fueran sobre productoras de proteasas, resultando 23 positivas. Se analizo in silico la secuencia de los insertos de tres de estas clonas positivas con GLIMMER3 y FgenesB, para anotar los genes contenidos en el ADN exogeno, y solamente en una de ella se encontraron dos genes con un dominio característico de proteasas. Estos genes, fueron nombrados, PrAY5 y PrAY6. Su tamano fue de 1845 pb y 1824 pb respectivamente y tuvieron una identidad entre si de 66.5 %. Cuando sus ORFs fueron analizados mediante BLASTp en la base de datos no redundante del NCBI, mostraron una identidad de 60% y 68% respectivamente con una peptidasa S8 de Chitinimonas koreensis. Un analisis filogenético utilizando la secuencia de sus respectivas proteinas maduras, mostro que PrAY5 y PrAY6 agrupan dentro de la familia S8_13; la cual, de acuerdo con la base de datos de dominios conservados CDD, es una familia de proteasas no caracterizada. Un analisis estructural 3D mostro que PrAY5 y PrAY6 codifican zimogenos complejos, que contienen un péptido senal, un propeptido N-terminal, una zona del sitio activo y un propeptido C-terminal con un dominio de prepeptidasa carboxi terminal PPC. Su sitio activo contiene una triada catalitica compuesta por los aminoacidos D, H y S, la cual es caracteristica de las peptidasas S8, así como un oxianion, el cual tambien participa en la catalisis. Cuando cada uno de los ORFs fue subclonado individualmente en el vector de expresion pLATE52, las clonas resultantes mostraron un fenotipo proteolitico, lo cual sugiere que ambos pueden ser expresados independientemente y sus productos pueden ser procesados y secretados sin necesitar uno del otro. Todos estos resultados demuestran que, con la estrategia empleada, es factible obtener genes de proteasas novedosos con posible potencial biotecnológico.

  • English

    Proteases (synonym of peptidases) (EC 3.4) are hydrolytic enzymes which catalyze the cleavage of peptide bonds of other proteins, and in some cases they even have the capacity to cleave themselves. They are used for a wide range of applications, especially in detergent, food and pharmaceutical industries. In this study, a fosmid metagenomic library of Yucatan underground water was constructed. About 250,000 clones harboring ~35,000 bp environmental DNA (eDNA) inserts were recuperated, and when 21,000 of these clones were screened for protease-overproduction, 23 of them resulted positive.

    When the exogenous eDNA sequences contained in three of these positive clones were analyzed by GLIMMER3 and fgenesB, two genes comprising protease domains were detected in clone MAJ10. These genes, called PrAY5 and PrAY6, were 1,845 bp and 1,824 bp long respectively, and shared 66.5% identity. When their translated ORFs were analyzed by BLASTp in the NCBI nr database, they showed 60% and 68% identity respectively with a peptidase S8 of Chitinimonas koreensis. A phylogenetic analysis of their active sites showed that PrAY5 and PrAY6 grouped within the family S8_13, which according to the CDD database, is an uncharacterized protease family. A 3D structural analysis showed that both PrAY5 and PrAY6 encode complex zymogens, which have a signal peptide, an N-pro-peptide, a mature core enzyme, and a C-pro-peptide containing a PPC domain. Their active site contains a catalytic triade composed by the amino acids D, H, and S, which is characteristic of peptidases S8, as well as an oxyanion hole, which also participate in the catalysis. When both ORFs were individually sub-cloned in the expression vector pLATE52, the resulting sub-clones showed a proteolytic phenotype when grown on the testing medium, suggesting that they can be independently expressed, and their products can be independently secreted. All these results together point out that by the followed strategy, two novel protease genes with biotechnological potential was discovered.