Insecticidas gabaérgicos: desarrollo de herramientas para screening virtual y análisis de su interacción con membranas lipídicas

• Autores: Iván Felsztyna
• Directores de la Tesis: Daniel A. García (dir. tes.), Virginia Miguel Lopez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional de Córdoba (UNC) ( Argentina ) en 2023
• Idioma: español
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: hdl.handle.net
• Resumen
  • español

    En el sistema nervioso de los insectos, el receptor ionotrópico para el ácido γaminobutírico (GABA) es un homopentámero de la subunidad conocida como RDL. Este receptor, perteneciente a la familia de los canales iónicos pentaméricos activados por ligando (pLGICs), es un blanco para insecticidas, algunos de los cuales muestran selectividad por esta proteína respecto de los receptores GABAA (R-GABAA) de mamíferos. Existe en la actualidad una necesidad de desarrollar nuevos insecticidas de baja toxicidad, principalmente para el control de insectos vectores de enfermedades.

    Una de las estrategias utilizadas para encontrar compuestos con una bioactividad determinada es el screening virtual (SV) basado en docking molecular. Para llevar a cabo un SV se requiere contar con la estructura tridimensional de la proteína blanco. En el caso del receptor RDL, no se ha determinado hasta el momento su estructura por medio de técnicas experimentales, por lo cual trabajos previos han recurrido al modelado por homología. Sin embargo, no se ha prestado suficiente atención al impacto que podría tener el estado conformacional farmacológico del templado mediante el cual se obtienen estos modelos a la hora de realizar cálculos de docking con insecticidas bloqueantes del receptor.

    En esta tesis se obtuvieron diversos modelos del receptor RDL en base a templados pLGICs en distintos estados conformacionales. Con estas estructuras, se llevó a cabo un SV retrospectivo con insecticidas conocidos para el sitio de los antagonistas nocompetitivos IA, con el objetivo de evaluar cuáles son las propiedades estructurales determinantes para un screening exitoso. Se describió así que el tamaño de la cavidad de unión y el diámetro de poro a la altura de los residuos 2’Ala influyen significativamente sobre el desempeño del screening. En base a estos resultados, se llevó a cabo un SV prospectivo de compuestos naturales utilizando un modelo en estado cerrado del receptor RDL, el cual mostró el mejor desempeño en la etapa retrospectiva. Como resultado, un conjunto de compuestos es propuesto para su futura validación experimental como posibles antagonistas del receptor RDL, mostrando potencial selectividad sobre esta proteína respecto del R-GABAA humano.

    Por otra parte, se conoce que numerosas drogas lipofílicas con actividad sobre el RGABAA provocan también efectos inespecíficos sobre la membrana lipídica, lo cual es relevante dado que el R-GABAA es una proteína integral de membrana. El fipronil es uno de los insecticidas comerciales que tienen como blanco de acción al receptor RDL. A pesar de su alta lipofilicidad, no se había estudiado hasta el momento su posible efecto sobre membranas lipídicas. Mediante metodologías experimentales y simulaciones de dinámica molecular, en esta tesis se analizó la interacción del fipronil con modelos de monocapas y de bicapas lipídicas del fosfolípido DPPC. El fipronil fue capaz de penetrar e incorporarse a las membranas, ubicándose en la región comprendida entre las cadenas hidrocarbonadas y el glicerol, modificando propiedades tales como el grado de empaquetamiento, la elasticidad y el orden de las cadenas hidrocarbonadas. Estos efectos inespecíficos podrían contribuir, al menos parcialmente, al mecanismo de acción de este insecticida.

  • English

    In the insect nervous system, the γ-aminobutyric acid (GABA) ionotropic receptor is a homopentamer formed by the protein subunit known as RDL. This receptor, that belongs to the pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs) family, is a protein target for insecticides. Some of these insecticides show selectivity for this protein over the mammalian GABAA receptors (GABAA-R). Currently, the development of new lowtoxicity insecticides is necessary, mainly for the control of vector-borne diseases.

    One of the strategies used to find chemical compounds with a certain bioactivity consists of performing a docking-based virtual screening (VS). To carry out a VS process, it is required to know the three-dimensional structure of the target protein. In the case of the RDL receptor, until now its structure has not been experimentally determined.

    Therefore, previous works have used the homology modeling technique to obtain it.

    However, not enough attention has been paid to the impact that the template conformational state could exert on the performance of molecular docking assays with insecticides that block the RDL ion channel.

    In this thesis, several RDL receptor homology models were obtained based on pLGICs templates in different conformational states. With these structures, a retrospective VS with known insecticides binding to the non-competitive antagonists IA site was performed to evaluate which are the determinant structural properties for a successful screening. In this way, it was described that the binding site size and the pore diameter at 2’Ala residues significantly impact on the screening performance. Based on these results, a prospective VS was carried out with natural compounds, using a closed-state model of the RDL receptor, which showed the best performance in the retrospective stage. As a result, a set of compounds are proposed for their future experimental validation as possible RDL receptor antagonists with potential selectivity on this protein over the human GABAA receptor.

    Besides, it is known that numerous lipophilic drugs that are active on GABAA receptors also exert non-specific effects on the lipid membrane, which is relevant given that the GABAA-R is an integral membrane protein. Fipronil is one of the commercial insecticides that target the RDL receptor. Despite its high lipophilicity, its possible effects on lipid membranes had not been studied yet. Through a combination of experimental methodologies and molecular dynamics simulations, in this thesis the interaction of fipronil with lipid monolayer and bilayer models formed by the phospholipid DPPC was analyzed.

    Fipronil was able to penetrate into lipid membranes, locating in the region between the acyl chains and glycerol and modifying properties such as the molecular packing, the elasticity and the acyl chains order. These non-specific effects could contribute, at least in part, to the mechanism of action of fipronil.