Functional and structural characterization of the CCDC6-RET fusion product

• Autores: Ana Martín Hurtado
• Directores de la Tesis: Iván Plaza Menacho (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2024
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 151
• Títulos paralelos:
  • Caracterización funcional y estructural del producto de fusión CCDC6-RET
• Tribunal Calificador de la Tesis: María Dolores Pérez-Sala Gozalo (presid.), Gemma Domínguez Muñoz (secret.), Javier Muñoz Peralta (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares por la Universidad Autónoma de Madrid
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • La reacción de fosforilación es catalizada por quinasas, las cuales transfieren el grupo gamma-fosfato del ATP a la molécula diana. Esta reacción regula no solo la función de las proteínas, sino que desempeña un papel crucial en el control de casi todos los procesos celulares. Los productos de fusiones génicas que involucran proteínas quinasas son conocidos inductores del cáncer humano y dianas terapéuticas. En particular, las fusiones que involucran el dominio catalítico del receptor tirosina quinasa RET, se han vuelto especialmente relevantes en la terapia contra el cáncer, aunque los determinantes estructurales y moleculares que controlan su función están en gran parte inexplorados. En este trabajo de tesis proporcionamos el primer modelo del mecanismo de activación para el producto de fusión oncogénico CCDC6-RET, un “driver” del carcinoma papilar de tiroides (PTC) y del cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC).

    El modelo canónico de activación de RET requiere de un complejo de ensamblaje entre el ligando y el co-receptor en la membrana celular para la heterodimerización, activación y posterior autofosforilación de los sitios intracelulares. Aquí, mostramos que CCDC6-RET es un dímero altamente activo en solución, que muestra cinéticas más rápidas de autofosforilación y mayor actividad catalítica en comparación con el dominio quinasa de RET aislado (monomérico). El análisis llevado a cabo por espectrometría de masas unido a una robusta caracterización bioquímica y biofísica reveló que CCDC6-RET es una quinasa con especificidad dual en residuos tirosina y serina/treonina, y aún más sorprendente que CCDC6-RET es una quinasa dual dependiente de ATP y ADP. Asimismo, identificamos una interacción entre el segmento C-terminal y el de activación, descubriendo una dependencia, mutuamente excluyente, del primero con los sitios de fosforilación del segmento de activación, que controla tanto el procesamiento como la actividad catalítica de la proteína fusión. También, demostramos que las isoformas del C-terminal de CCDC6-RET generadas por “splicing” presentan propiedades catalíticas similares, aunque fosforilan un conjunto diferente de sustratos en un sistema celular.

    Además, realizamos una caracterización estructural de CCDC6-RET mediante una combinación de microscopía electrónica, SAXS, espectrometría de masas con “cross-linking” y análisis estructurales in silico. De esa forma, obtuvimos un primer modelo homodimérico de CCDC6-RET en el cual forma un dímero trans-inhibido cara a cara en el estado apo. Tras la unión del nucleótido y la reorientación de los dominios catalíticos, CCDC6-RET es capaz de autofosforilarse mediante un mecanismo en cis. Por lo tanto, nuestro trabajo revela por primera vez los determinantes estructurales y moleculares que controlan la función de CCDC6-RET, así como proporciona un marco sólido para estudiar la estructura y función de otros productos de fusión de RET