Búsqueda de inhibidores de la ribonucleasa P bacteriana que interaccionen con su subunidad proteica

• Autores: Ezequiel Alejandro Madrigal Carrillo
• Directores de la Tesis: Alfredo Torres-Larios (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Nacional Autónoma de México ( México ) en 2021
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Bacterial ribonuclease P inhibitor screening through binding to its protein subunit
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  ru.dgb.unam.mx  tesiunamdocumentos.dgb.unam.mx (html) 
• Resumen
  • español

    La ribonucleasa P (RNasa P) es un complejo ribonucleoproteico esencial que participa en la biosíntesis de proteínas entodos los organismos vivosvía la maduración delos precursores del ARN de transferencia (pre-tRNAs) mediante la escisióndel enlace fosfodiéster de suextremo 5’-líder. En este trabajo,consideramosa la subunidad proteica de la RNasa P (proteínaP) como blanco promisorio para eldescubrimiento de nuevos antibióticosdado el incremento de patógenos resistentes a múltiples fármacos a escala global. Esta consideración,se debea queexisten diferencias de los componentes proteicos en eucaria y archaea con respecto a la RNasa P bacteriana. La subunidad de ARN (ARN P) contiene regiones universalmente conservadas, incluyendo el sitio catalítico, lo cual compromete la especificidad de un inhibidor desarrollado contra esta subunidad. En el presente estudio desarrollamos una plataforma de búsqueda en libreríasde compuestosa través del análisisactividad-unión-estructura,para lo cual semontó un ensayo de unión de moléculas pequeñas para los diferentes componentes de la RNasa P medianteinterferometría de biocapas(BLI). Se optimizó un ensayo de actividad en tiempo real de alto rendimiento medianteespectroscopía de fluorescencia y se montó una metodología para obtener cristales y resolver la estructura terciariade la proteína P en complejo con diferentes moléculas pequeñas. A partir de esta última estrategia, se determinaron las primeras tresestructuras cristalográficas de la proteína P en complejo con moléculas pequeñas. Dos de estas estructuras confirmaron la existencia de un sitio en la proteína P para la unión de moléculas pequeñas. Una de estas estructuras se encuentra en complejo con el fragmento 2-mercaptobenzoxazol (2-MBX), el cual pudo ser optimizado para obtener dos compuestos (C-7 y C-10) que muestran una mayor afinidad por la proteína Pyactividad antibacteriana.La tercera estructura resuelta correspondea la proteína P en complejo con el inhibidor purpurina, que actúa mediante la unión a la subunidad proteica. Este inhibidor se detectó a través del ensayo de actividad de la RNasa P mediante fluorescencia. Posteriormente, se recurrió a la técnica de BLI ya ensayos de actividad adicionales para caracterizar el mecanismo de inhibición, a partir de lo cual se infirió que la purpurina se une a la proteína P y a la holoenzima, pero no a la subunidad de ARN. La estructura cristalográfica de la proteína P en complejo con la purpurina, confirmó que el sitio de unión del inhibidor es importante para la función biológica de la holoenzima.

  • English

    Ribonuclease P (RNase P) is an essential ribonucleoprotein complex involved inthe biosynthesis of proteins in all organisms viathe maturation of all transfer RNA precursors (pre-tRNAs) through the phosphodiester bond cleavage of its 5’-leader sequence. In this work, we consider the RNase P protein subunit(P protein) as a promising target for the discovery of antibioticsdue to the emergence of multiple resistant-drugs pathogens at a global scale. Thisconsiderationis derived from the fact that there are key differences between the RNase P protein subunits from eukarya and archaeacompared to that of bacterial RNase P. The RNA subunit (P RNA) contains universally conserved regions, including the catalytic site, compromising the specificity of any inhibitor developed against this subunit. Here, we developed anactivity-binding-structure platformfor compound library screening, for which an assay was set to search for the binding of small molecules to the RNase P subunits and substrates by biolayer interferometry (BLI); a high-throughput activity assay by fluorescence spectroscopy wasoptimized for detection of RNase P inhibitors and an experimental methodology was set for growing crystals and solving crystallographic structures of the P protein in complex with small molecules. From the latter strategy, it was possible to obtain the first three crystal structures of the P protein in complex with small molecules. Two of these structures showed that a binding site for small molecules on the P proteinexists. One of these structures is in complex with the fragment 2-mercaptobenxozazole (2-MBX), which was optimized to compounds C-7 and C-10, which displayed higher affinity for the P protein and antibacterial activity. The third crystal structure solved is thatof the P protein in complex with theinhibitor purpurin, which acts throughbinding to the P protein subunit. This inhibitor was detected through theRNase P activity assay by fluorescence spectroscopy. We applied the BLI technique and further activity assays to characterize the inhibition mechanism, and from this approach it was inferred that purpurin binds to the P protein and to the holoenzyme, but not to P RNAsubunit. The crystallographicstructure of the P protein in complex with purpurinconfirmed that thebinding site of the inhibitor is important for the biological function of the holoenzyme.