Resumen de Evaluation of the toxicogenetic potential of visceral leishmaniasis in naturally infected dogs and salivary samples for definitive disease diagnosis

Carolaine Oliveira Alvarenga, Ricardo Andrade Furtado, Rafael Paranhos de Mendonça, Lucas de Freitas Pereira, Isadora Pezati Sabino, Simone Bonattini Martinez, Brenda Faria Santos Gomes Parreira, Fernanda Gosuen Gonçalves Dias

• español

  La leishmaniasis visceral es una enfermedad infecciosa y zoonótica causada por el protozoo Leishmania infantum chagasi, transmitida por la picadura del flebótomo Lutzomyia longipalpis, con perros que sirven como reservorio principal. Dada la creciente propagación de esta enfermedad en los perros y su importancia epidemiológica y de salud pública, este estudio tuvo como objetivo investigar si las muestras salivales de perros infectados naturalmente podrían servir como herramienta de diagnóstico, tratando de reemplazar los métodos convencionales invasivos. Además, el estudio analizó los posibles efectos toxicogenéticos de la enfermedad. Se incluyeron 10 perros adultos, tanto machos comohembras, intactos y castrados, de raza mixta, de Rifaina (SP) y atendidos en el Hospital Veterinario de la Universidad de Franca. Estos perros mostraron varios signos clínicos que sugieren leishmaniasis visceral, con cinco de ellos confirmados a través deexámenes serológicos y parasitológicos. Las muestras salivales se recolectaron con hisopos estériles de los cinco perros seropositivos, se colocaron en portaobjetos de vidrio y se teñieron con hematoxilina-eosina para el análisis posterior de las formas de amastigoto del protozoo mediante microscopía de campo brillante; los resultados fueron descriptivos. Además, se recogieron muestras de médula ósea del esternón de los cinco perros seropositivos y se compararon con las de los cinco perros seronegativos para investigar el potencial toxicogenético de la enfermedad a través de la prueba de micronúcleos. Para evaluar la posible genotoxicidad, se analizó cada portaobjetos de médula ósea para 2000 eritrocitos inmaduros (IE), con un total de 4000 IE/animal, y se identificaron aquellos que contenían micronúcleos (MN) (IE-MN). La citotoxicidad se determinó analizando 1000 eritrocitos/portaobjetos, totalizando 2000 eritrocitos/perro, y posteriormente calculando la relación IE/IE+NCE (eritrocitos normocromáticos). Se compararon los resultados toxicogenéticos de los perros seropositivos con los seronegativos y se verificaron estadísticamente mediante análisis simple de varianza (ANOVA). El protozoo Leishmania no fue detectado en ninguna de las muestras salivales de perros seropositivos. La frecuencia media de IE-MN en perros seropositivos fue estadísticamente mayor en comparación con perros seronegativos (p<0,0001), lo que indica la genotoxicidad de la enfermedad. En dos de los cinco perros seropositivos, una disminuciónen la producción de eritrocitos sugirió citotoxicidad de la enfermedad. Dada la metodología establecida, se puede inferir que el análisis simple de la saliva, sin ensayos más específicos, no detecta formas amastigotas del protozoo en perros seropositivos para la leishmaniasis visceral y no debe reemplazar los métodos de diagnóstico establecidos. Además, la prueba de micronúcleos sugirió la genotoxicidad y citotoxicidad de la enfermedad.

• English

  Visceral leishmaniasis is an infectious and zoonotic disease caused by the protozoan Leishmania infantum chagasi, transmitted through the bite of the sandfly Lutzomyia longipalpis, with dogs serving as the primary reservoir. Given the increasing spread of this disease in dogs and its epidemiological and public health significance, this study aimed to investigate whether salivary samples from naturally infected dogs could serve as adiagnostic tool, attempting to replace invasive conventional methods. Additionally, the study analyzed the potential toxicogenetic effects of the disease. Ten adult dogs, both males and females, intact and neutered, of mixed breed, from Rifaina (SP) and attendedat the Veterinary Hospital of the University of Franca, were included. These dogs exhibited various clinical signs suggestive of visceral leishmaniasis, with five of them confirmed through serological and parasitological examinations. Salivary samples were collected using sterile swabs from the five seropositive dogs, placed on glass slides, and stained with hematoxylin-eosin for subsequent analysis of amastigote forms of the protozoan using bright-field microscopy; the results were descriptive. Furthermore, bone marrow samples from the sternum were collected from the five seropositive dogs and compared with those from the five seronegative dogs to investigate the toxicogenetic potential of the disease through the micronucleus test. To assess possible genotoxicity, each slide made from bone marrow was analyzed for 2000 immature erythrocytes (IE), totaling 4000 IE/animal, and those containing micronuclei (MN) were identified (IE-MN). Cytotoxicity was determined by analyzing 1000 erythrocytes/slide, totaling 2000 erythrocytes/dog, and subsequently calculating the ratio of IE/IE+NCE (normochromatic erythrocytes). Toxicogenetic results of seropositive dogs were compared with seronegative dogs and statistically verified by simple analysis of variance (ANOVA). The protozoan Leishmania was not detected in any of the salivary samples from seropositive dogs. The mean frequency of IE-MN in seropositive dogs was statistically higher compared to seronegative dogs (p<0.0001), indicating the genotoxicity of the disease. In two of the five seropositive dogs, a decrease in erythrocyte production suggested cytotoxicity of the disease. Given the established methodology, it can be inferred that simple saliva analysis, without more specific assays, does not detect amastigote forms of the protozoan in dogs seropositive for visceral leishmaniasis and should not replace established diagnostic methods. Additionally, the micronucleus test suggested the genotoxicity and cytotoxicity of the disease.

• português

  A leishmaniose visceral é uma doença infecciosa e zoonótica causada pelo protozoário Leishmania infantum chagasi, transmitida pela picada do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, tendo o cão como reservatório primário. Dada a crescente propagação desta doença em cães e o seu significado epidemiológico e de saúde pública, este estudo teve como objetivo investigar se amostras salivares de cães naturalmente infectados poderiam servir como ferramenta de diagnóstico, tentando substituir os métodos convencionais invasivos. Além disso, o estudo analisou os potenciais efeitos toxicogenéticos da doença. Foram incluídos dez cães adultos, machos e fêmeas, íntegros e castrados, sem raça definida, provenientes de Rifaina (SP) e atendidos no Hospital Veterinário da Universidade de Franca. Esses cães apresentavam diversos sinais clínicos sugestivos de leishmaniose visceral, sendo cinco deles confirmados por exames sorológicos e parasitológicos. Amostras salivares foram coletadas com swabs estéreis dos cinco cães soropositivos, colocados em lâminas de vidro e corados com hematoxilina-eosina para posterior análise das formas amastigotas do protozoário por meio de microscopia de campo claro; os resultados foram descritivos. Além disso, amostras de medula óssea do esterno foram coletadas dos cinco cães soropositivos e comparadas com as dos cinco cães soronegativos para investigação do potencial toxicogenético da doença através do teste do micronúcleo. Para avaliar possível genotoxicidade, cada lâmina confeccionada de medula óssea foi analisada para 2.000 eritrócitos imaturos (IE), totalizando 4.000 IE/animal, e foram identificados aqueles contendo micronúcleos (MN) (IE-MN). A citotoxicidade foi determinada analisando 1.000 eritrócitos/lâmina, totalizando 2.000 eritrócitos/cão, e posteriormente calculando a relação IE/IE+NCE (eritrócitos normocromáticos). Os resultados toxicogenéticos de cães soropositivos foram comparados com cães soronegativos e verificados estatisticamente por análise de variância simples (ANOVA). O protozoário Leishmania não foi detectado em nenhuma amostra salivar de cães soropositivos. A frequência média de EI-MN em cães soropositivos foi estatisticamente maior em comparação aos cães soronegativos (p<0,0001), indicando a genotoxicidade da doença. Em dois dos cinco cães soropositivos, uma diminuição na produção de eritrócitos sugeriu citotoxicidade da doença. Dada a metodologia estabelecida, pode-se inferir que a simples análise da saliva, sem ensaios mais específicos, não detecta formas amastigotas do protozoário em cães soropositivos para leishmaniose visceral e não deve substituir os métodos diagnósticos estabelecidos. Além disso, o teste do micronúcleo sugeriu genotoxicidade e citotoxicidade da doença.