Optimización de ddPCR y desarrollo de módulos multiplex para el análisis de eventos de modificación genética en maíz

• Autores: Ángel de León Márquez Luna, Ofelia Yadira Lugo Melchor, Erika Nahomy Marino Marmolejo, Martha Alicia Rentería Ledesma
• Localización: Agrociencia, ISSN 2521-9766, ISSN-e 1405-3195, Vol. 55, Nº. 8, 2021, págs. 663-680
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • ddPCR optimization and development of multiplex modules for analyzing events of genetic modification in maize
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    La siembra, comercialización y consumo de maíz transgénico es motivo de debate en México, ya que es centro de origen y diversificación de variedades y razas de maíz nativo. La reacción en cadena de la polimerasa digital por goteo (droplet digital PCR, ddPCR) ha demostrado ser más eficiente que el estándar de oro para el análisis de maíz modificado genéticamente. Por tanto, el objetivo fue optimizar pruebas de ddPCR para el análisis de transgenes en maíz y generar módulos multiplex de detección. Por medio de un análisis bioinformático se evaluó la aplicabilidad de los iniciadores. Después, con gradientes se determinó una temperatura de hibridación y elongación óptima y se evaluó la concentración de iniciadores, la recuperación de gotas y el efecto “lluvia”. La optimización se verificó por medio de pruebas dúplex, y finalmente se desarrollaron módulos multiplex. La temperatura que permitió una separación clara entre clústeres de gotas positivas y negativas para las 11 pruebas símplex fue 58.5 °C, con concentraciones relativamente bajas de iniciadores y sondas. Las gotas recuperadas resultaron adecuadas según el propósito de los análisis y la “lluvia” obtenida resultó irrelevante. En las pruebas dúplex se confirmó el potencial para la cuantificación sin usar curvas de calibración; la mayoría de los ensayos concordaron con los reportes de validación o con los porcentajes teóricos de variabilidad genética. Por último, en los módulos multiplex se realizaron variaciones en la concentración de iniciadores y sondas para diferenciar clústeres de gotas positivas en un canal detector único. Las mejores diferencias se lograron con concentraciones con diferencias de 1:3. Los resultados mostraron que las pruebas optimizadas son adecuadas para la detección y posible cuantificación de 10 transgenes en maíz.

  • English

    The planting, marketing and consumption of transgenic maize is a matter of debate in Mexico, since it is a centre of origin and diversification of native maize varieties and breeds. The droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) has proven to be more efficient than the gold standard test (qPCR) for the analysis of genetically modified maize. Therefore, the objective was to optimize ddPCR tests for transgene analysis in maize and to generate multiplex detection modules. The applicability of the primers was evaluated by bioinformatics analysis. Then, using gradients, an optimal hybridization and elongation temperature was determined and the primers concentration, droplet recovery and the “rain” effect were evaluated. Optimization was verified by duplex testing, and finally multiplex modules were developed. The temperature that allowed a clear separation between positive and negative droplet clusters for the 11 simplex tests was 58.5 °C, with relatively low concentrations of primers and probes. The recovered droplets were adequate for the purpose of the analyses and the “rain” obtained was irrelevant. In the duplex tests, the potential for quantification was confirmed without using calibration curves; most assays agreed with validation reports or with theoretical percentages of genetic variability. Finally, in the multiplex modules, variations in primers and probe concentration were performed to differentiate clusters of positive droplets in a single detector channel. The best differences were achieved at concentrations with 1:3 differences. The results showed that the optimized tests are suitable for the detection and possible quantification of 10 transgenes in maize.