Optimización de una técnica para aislamiento de ADN genómico de espermatozoides de toro

• Autores: Martha Vázquez Aguirre, Javier Valencia Méndez, Manuel Barrientos Morales, Noé Orlando Juárez López, Alejandro Córdova Izquierdo, Juan M. Pinos Rodríguez, María de Lourdes Juárez Mosqueda
• Localización: Agrociencia, ISSN 2521-9766, ISSN-e 1405-3195, Vol. 54, Nº. 8, 2020, págs. 1059-1077
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Optimization technique for genomic DNA isolation from bovine sperm
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    Los espermatozoides de toro exhiben estructuras específicas que protegen su ADN y, por lo tanto, las técnicas estándar utilizadas para el aislamiento del ADN somático no son eficientes. Así pues, nuestro objetivo fue diseñar un aislamiento del ADN de espermatozoides de toro que fuera económico, rápido y eficiente, con la hipótesis de que la combinación adecuada de agentes químicos y un conjunto de alternativas nos permitirían diseñar un método mejorado para extraer el ADN de los espermatozoides de toro para su utilización en los ensayos de PCR. Una serie de réplicas obtenidas de cinco eyaculados se utilizó para evaluar seis métodos de extracción de ADN de espermatozoides de toro: 1) el método convencional que utiliza la proteinasa K y el fenol-cloroformo; 2) el método de papaína, DTT, DMSO, CTAB y SDS (para solubilizar la teca perinuclear y reemplazar el fenol-cloroformo); 3) el método del detergente no iónico Brij 36-T para eliminar la membrana plasmática; 4) el método del DTT y la heparina para la descondensación de la cromatina nuclear; 5) el método SDS y; 6) el método CTAB para eliminar la membrana plasmática. Las muestras de ADN se analizaron espectrofotométricamente para determinar la concentración y la pureza del ADN, y luego se utilizaron en cinco cantidades (200, 100, 50, 25 y 12.5 ng) para los análisis de PCR. Para evaluar la repetibilidad del método, se realizaron réplicas del procedimiento más eficiente. Los resultados mostraron que el mejor método para la extracción de ADN de espermatozoides de toro fue el sexto, basado en el uso del CTAB como agente de remoción de membranas; papaína, DTT y DMSO como tampón de lisis y DTT, heparina y SDS como solución de descondensación, y se logró una concentración que oscilaba entre 63 y 154 ng µL-1 y una calidad óptima (A260/A280= 1.75 y 1.73) en la extracción de semen fresco y congelado, respectivamente. En conclusión, considerando las características estructurales del espermatozoide, diseñamos un método simple y eficiente para extraer el ADN de los espermatozoides de toro sin limitaciones en la PCR. Además, todo el procedimiento puede realizarse en un período corto de tiempo, sin necesidad de emplear el tratamiento con fenol-cloroformo y proteinasa K.

  • English

    The bull sperm cells exhibit specific structures that protect their DNA, and therefore, the standard techniques used for somatic DNA isolation are not efficient. Thus, our objective was to design an inexpensive, quick and efficient bull sperm DNA isolation, under the hypothesis that the appropriate combination of chemical agents and a set of alternatives would allow us to design an improved method to extract DNA from bull sperm to be used in PCR assays. A series of replicates obtained from five ejaculates were used to evaluate six methods to extract bull sperm DNA: 1) the conventional method using proteinase K and phenol-chloroform; 2) papain, DTT, DMSO, CTAB, and SDS method (to solubilize the perinuclear theca and to replace phenol-chloroform); 3) the nonionic detergent Brij 36-T method, to remove the plasma membrane; 4) DTT and heparin method, for nuclear chromatin de-condensation; 5) SDS method and; 6) CTAB method, to remove the plasma membrane. DNA samples were analyzed spectrophotometrically to determine the DNA concentration and purity, then used at 200, 100, 50, 25, and 12.5 ng for PCR assays. To evaluate repeatability of the method, replicates of the most efficient procedure were performed. Results showed that the best method for bull sperm DNA extraction was the use of CTAB as a membrane removal agent; papain, DTT and DMSO as lysis buffer and DTT, heparin, and SDS as decondensing solution, achieving concentration ranging from 63 to 154 ng mL-1 and optimal quality (A260/A280= 1.75 and 1.73) in fresh and frozen semen extracting, respectively. In conclusion, considering the structural characteristics of the sperm cell, we designed a method simple and efficient for extracting bull sperm DNA without limitations in PCR. Also, the whole procedure can be done in a short period of time without the need to employ phenol-chloroform and proteinase K treatment