Procesamiento postraduccional de la porción no opioide de la proencefalina (Synencefalina) en el cerebro de la rata
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[1] Laboratorio de Análisis Químicos. División de Neurociencias. Instituto Mexicano de Psiquiatría
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- Localización: Salud mental, ISSN 0185-3325, Vol. 23, Nº. 3, 2000, págs. 13-19
- Idioma: español
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Resumen
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Los péptidos biológicamente activos se producen por el procesamiento enzimático de un precursor protéico inactivo y de alto peso molecular. El precursor de los péptidos opioides contiene cuatro copias de Met-encefalina, una copia de Leuencefalina, una copia del heptapéptido y una copia del octapéptido. En su porción amino terminal se encuentra una región de 70 aminoácidos que no contiene ninguna copia de los péptidos opioides, a la que se le ha denominado synencefalina (Syn). Los primeros trabajos demostraron que la secuencia completa de la Syn (8.6 kDa de peso molecular), no sufría cambios postraduccionales en el sistema nervioso de los mamíferos, y se liberaba íntegramente de sus terminales nerviosas. Las evidencias posteriores señalaron que en el sistema inmune, la Syn se podía transformar en un péptido de 1 kDa. A este último péptido se le ha involucrado con los procesos de proliferación celular, y con el sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario. Sin embargo, no hay evidencias experimentales que demuestren que la Syn pueda ser procesada a un péptido de bajo peso molecular en el cerebro de la rata adulta. El propósito del presente trabajo fue el de analizar por medio de métodos bioquímicos si la Syn es capaz de procesarse en el sistema nervioso, así como establecer la identidad bioquímica del material inmunoreactivo a la Syn que se libera a partir de las terminales nerviosas del cuerpo estriado.
Un grupo de ratas macho de la cepa Wistar (230 g) fueron sacrificadas, y se disectó el cuerpo estriado. El tejido se dividió en tres grupos: 1) El estriado se homogeneizó y se centrifugó; el sobrenadante se liofilizó y se resuspendió en 2 ml de agua. 2) El cuerpo estriado se sometió al proceso de liberación in vitro a partir de las rebanadas del cuerpo estriado (300 mm), utilizando potasio (55 mM) como estímulo despolarizante. El perfusado fue liofilizado y resuspendido en 2 ml de agua. 3) Del cuerpo estriado se obtuvo una fracción enriquecida con terminales nerviosas aisladas (sinaptosomas) y sometidas a la liberación in vitro. Los perfusados se liofilizaron y se resuspendieron en 2 ml de agua. Las muestras anteriores se aplicaron por separado a una columna con Sephadex G-50. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Muestra 1. El cromatograma muestra varias proteínas inmunoreactivas a la synencefalina con diversos pesos moleculares, principalmente las fracciones 13.7, 8.1 y 2.5 kDa. El tejido completo no mostró inmunoreactividad en la porción de 1.0 kDa. Muestra 2. El material liberado presentó un perfil cromatográfico distinto toda vez que los precursores presentes en el tejido completo se procesaron completa y rápidamente a un péptido de 1.0 kDa de peso molecular. Muestra 3. La muestra obtenida de los sinaptosomas mostró un comportamiento similar al descrito en el inciso 2, ya que el material liberado es inmunoreactivo a la Syn de 1.0 kDa de peso molecular.
Los datos obtenidos demuestran que en el cuerpo estriado, la inmunoreactividad a la Syn se ubica, principalmente, en 3 proteínas, de las cuales la fracción de 8.6 kDa es la predominante; su peso molecular es semejante al descrito previamente. Sin embargo, cuando el tejido es sometido a un estímulo despolarizante con potasio, los precursores se procesan a un péptido de 1.0 kDa. El análisis de esta última fracción con la técnica de HPLC, demuestra que el tiempo de retención de la muestra coincide con la sustancia patrón utilizada (YESSHLLA), la cual tiene un peso molecular de 1.0 kDa. Los datos obtenidos de las terminales nerviosas aisladas sugieren la presencia de precursores de alto peso molecular. El perfil cromatográfico es similar al observado en las rebanadas del tejido, toda vez que la presencia de potasio induce el procesamiento de los precursores a un péptido de 1.0 kDa.
Las evidencias previas y los resultados del presente trabajo muestran que el cerebro de la rata adulta no procesa a la Syn de 8.6 kDa. Sin embargo, cuando las condiciones fisiológicas implican un incremento en la actividad celular, como: la proliferación celular, la respuesta a un estímulo que produce estrés, la inflamación y el aumento en la frecuencia de despolarización inducida in vitro, los precursores presentes en el tejido se procesan en forma rápida y completa a un péptido de bajo peso molecular (1.0 kDa), al cual se le ha involucrado con la fisiología de la porción no opioide de la proencefalina A.
- English
Several protein hormones and neuropeptides are derived by enzymatic cleavage from a large and inactive peptide precursor. The enkephalins’ precursor, the proenkephalin A (PA) has been deduced by sequencing cloned DNA. The PA contains four copies of Met-Enkephalin and one copy each of Leu-Enkephalin, heptapeptide and octapeptide. Proenkephalin (amino acids 1-70)does not contain any opioid peptide sequence and has been named synenkephalin (Syn). Initial evidences suggested that Syn is produced and secreted as an intact molecule or as part of the precursors in the adult brain and adrenal medulla, respectively. However, under specific physiological conditions, i.e., proliferating immune cells, Syn (8.6 kDa) it is processed to low molecular weight peptides (1.0 kDa). Until now there is no evidence of the production or release of a 1.0 kDa peptide derived from synenkephalin in the adult rat brain.
In this work we studied the postranslational processing of synenkephalin in rat striatum, either in whole tissue or in vitro release conditions.
Male Wistar rats were used throughout this experiment. The rats were sacrificad by decapitation and the striatum removed.
Samples were divided into three groups: 1) Thes striatum (n=8) was homogenized and centrifuged; the supernatant was lyophilized and resuspended in 2 ml water. 2) Striatum was dissected and sliced in two directions at 90° at 300 mm intervals with a tissue chopper. The slices were used for the assessment of the in vitro release of synenkephalin and Met-Enkephalin, using potassium as depolarized stimulus. 3) The synaptosomal fraction was obtained from striatum; samples were depolarized with potassium 55 mM, and the perfusates were lyophilized and resuspended in 2 ml water. Samples were individually applied to a Sephadex G-50 column. Eluates were lyophilized and resuspended in RIA buffer. Synenkephalin and Met-Enkephalin were measured by RIA using a C-terminally directed antiserum. Gel filtration chromatography (Sephadex G-50) showed that in the extracts of adult rat brain 45% of the IR-Synenkephalin eluted in the position of the authentic peptide (8.6 kDa), and the rest of the immunoreactivity corresponded to partially processed peptides of 4.8 and 2.5 kDa.
After depolarized stimulus the chromatogram showed a differential pattern. In both, slices and synaptosomal samples, synenkephalin was processed to a single peak with a molecular weight of 1.0 kDa. This last peptide, which was further characterized by HPLC, resembles the same retention time when compared to the standard reagent (YEESHLLA). IR-Met-Enkephalin in whole tissue (analyzed before and after enzymatic digestion with trypsin and carboxypeptidase B) corresponded mainly to non-processed products. These results indicate that the non-opioid portion of proenkephalin (synenkephalin-derived peptides) rather than the opioid portion (Met-Enkephalin-containing peptides) is fully cleaved to the 1.0 kDa peptide in the depolarized samples. These data suggest that Synenkephalin (1-70) is not processed in basal conditions in the adult brain. However, when the neuronal activity is increased, i.e., after depolarized stimulus, synenkephalin is fully processed to a low molecular weight peptide. This last peptide has been related to the physiology of the synenkephalinderived peptides.
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