Características inmunológicas de las células epiteliales limbales: análisis in vitro de la función del TLR4

• Autores: Y Garfias, M. Linares-Guerra, R. Suárez, A. Sánchez Navarro, M.C. Jiménez-Martínez
• Localización: Archivos de la Sociedad Española de Oftalmologia, ISSN 0365-6691, Vol. 82, Nº. 2 (Febrero), 2007, págs. 95-102
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Immunological characteristics of limbal epithelial cells: in vitro analysis of TLR4 function
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• Resumen
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    Objetivo: El objetivo del presente estudio fue determinar la expresión del TLR4 en el epitelio limbo esclero-corneal cultivado in vitro y determinar su función celular después de un estímulo con lipopolisacárido. Métodos: Las células epiteliales limbales fueron obtenidas a partir de rodetes esclero-corneales y se expandieron; las células fueron estimuladas con diferentes dosis de lipopolisacárido de E. Coli y Pseudomonas durante 24 h. Después de la estimulación las células fueron cosechadas e identificadas con anticuerpos contra TLR4 humano y analizadas por citometría de flujo; el mRNA total se obtuvo y se realizó RT-PCR para la identificación de TLR4. La secreción de TNF-alfa fue evaluada por ELISA en el sobrenadante. Resultados: Las células epiteliales limbales expandidas in vitro expresaron constitutivamente la molécula TLR4. Posterior a la estimulación con LPS, la expresión de TLR4 extracelular se aumentó tomando en cuenta la intensidad media de fluorescencia. Cuando se evaluó la expresión de mRNA de TLR4, la densidad aumentó, presentando el máximo de expresión con 10 ng/ml de LPS. Cuando la secreción de TNF-alfa fue evaluada, no se demostró diferencia en la concentración de esta citocina en el sobrenadante de las células estimuladas y las no estimuladas. Conclusiones: Aunque la expresión extracelular de TLR4 en las células epiteliales limbales estimuladas in vitro regula positivamente al TLR4, su función parece no estar asociada a la secreción de TNF-alfa por el epitelio limbal. Tomando en conjunto estos resultados coinciden con los propuestos que el epitelio corneal favorece que la córnea sea un sitio inmunoprivilegiado.

  • English

    The aim of the present study was to determine the expression of TLR4 on human limbal epithelial cells cultivated in vitro, and to determine its cellular function after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Methods: Limbal epithelial cells were isolated from sclera-corneal rims and stimulated for 24 hours with different doses of LPS from E. coli and from Pseudomonas. After stimulation, the cells were harvested, stained with antibodies against human TLR4 and analysed by flow cytometry. mRNA was obtained and RT-PCR was performed for the identification of TLR4. Secretion of TNF-alpha by these cells was evaluated by ELISA of the supernatant. Results: Limbal epithelial cells expanded in vitro constitutively expressed the TLR4 molecule. After stimulation of cells with LPS the average fluorescence intensity increased, indicating that the expression of extracellular TLR4 was augmented. The expression of TLR4 mRNA was also increased with LPS stimulation, with maximum expression measured at 10 ng/ml LPS. The level of TNF-alpha in the supernatant was not different between the stimulated and the non-stimulated cells. Conclusions: Although stimulation of in vitro limbal epithelial cells with LPS up-regulates the extracellular expression of TLR4, the function of TLR4 does not seem to be associated with the secretion of TNF-alpha by these cells. These results are consistent with the proposal that the corneal epithelium is an immunosilent site in the eye.