Applicability of the real-time PCR assay in the amplification of cyanobacterial DNA from preserved samples

• Autores: Catarina Churro, Elisabete Valério, Paulo Pereira, Vitor M. Vasconcelos
• Localización: Limnetica, ISSN 0213-8409, Vol. 34, Nº. 1, 2015, págs. 173-186
• Idioma: inglés
• Títulos paralelos:
  • Aplicabilidad del qPCR en tiempo real en la amplificación de ADN de cianobacterias procedente de muestras fijadas
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• Resumen
  • español

    El estudio y la vigilancia de las floraciones de cianobacterias implican a menudo el uso de muestras conservadas, con el fin de evitar la degradación celular. Sin embargo, las muestras conservadas pueden no ser adecuadas para los estudios de biología molecular, ya que los métodos de conservación pueden interferir con la calidad/cantidad del ADN. Este estudio pretende evaluar la aplicabilidad de la técnica de qPCR en tiempo real en muestras sometidas a diferentes métodos de conservación: (1) 15% de solución yodoyodurada de Lugol (2) 4% de formaldehído y (3) 25% de glutaraldehído. La capacidad para amplificar y cuantificar el ADN extraído de Planktothrix agardhii se evaluó utilizando un fragmento del gen rpoC1 en ambas muestras de agua bruta y en cultivos in vitro.

    No se obtuvo amplificación fiable de ADN a partir de muestras conservadas en glutaraldehído. El fragmento de gen rpoC1 se amplificó con éxito en ADN extraído de muestras conservadas en solución yodoyodurada de Lugol y formaldehído. En este caso, sin embargo, la cuantificación lograda por PCR en tiempo real no puede utilizarse para inferir el número de células; ya que los valores de Ct obtenidos a partir de muestras conservadas en lugol y formaldehído fueron significativamente más elevados que los valores de Ct obtenidos a partir de las muestras sin conservantes. Por lo tanto, PCR en tiempo real se puede utilizar para la detección y la identificación de cianobacterias en muestras conservadas, pero sin cuantificación fiable de células.

  • English

    The study and monitoring of cyanobacterial blooms often involves the use of preserved samples to avoid cellular degradation. However, preserved samples may not be suitable for molecular biology studies because preservation methods can interfere with DNA quality/quantity. Real-time quantitative PCR analysis (qPCR) has been widely applied in molecular analysis and is considered a promising method for monitoring purposes. This study intended to evaluate the applicability of the real-time qPCR technique in samples that were subjected to different methods of preservation: (1) 15% Lugol’s iodine solution (2) 4% formaldehyde and (3) 25% glutaraldehyde. The ability to amplify and quantify DNA extracted from Planktothrix agardhii was assessed using the rpoC1 gene as the target fragment in both raw water samples and in vitro cultures.

    No reliable DNA amplification was obtained from glutaraldehyde-preserved samples. Successful amplification was obtained from Lugol’s and formaldehyde-preserved samples. In this case, however, the quantification that was achieved by real-time PCR cannot be used to infer cell numbers, because the Ct values that were obtained from the Lugol’s and formaldehydepreserved samples were significantly higher than the Ct values that were obtained from the unpreserved samples. Therefore real-time PCR can be used for the detection and identification of cyanobacteria in preserved samples but no reliable cell quantification can be performed using this method.