Resumen de Aplicación de técnicas moleculares para determinar la incidencia y extensión de la colonización de plantas de olivo por los patotipos de Verticillium dahliae
Jesús Mercado Blanco, Melania Collado Romero, Dolores Rodríguez Jurado, Rafael Manuel Jiménez Díaz
La detección temprana, rápida y consistente de la infección en plantas de olivo por los patotipos (defoliante D] y no defoliante [ND]) de V. dahliae es, entre otros, una acción clave para desarrollar con éxito una estrategia de control integrado de la Verticilosis del olivo, cuya aplicación para la certificación de material de plantación como libre del patógeno ayudaría a prevenir la utilización de material de olivo infectado. Nuestro grupo de trabajo ha desarrollado un procedimiento molecular para el diagnóstico especifico y efectivo de los patotipos de este hongo, e introducido subsecuentemente mejoras en el mismo para eliminar cualquier ambigüedad en la detección in planta que pudiera producirse por la coinfección de una misma planta por ambos patotipos en condiciones naturales. En este artículo presentamos un procedimiento refinado de diagnóstico molecular de los patotipos de V. dahliae, basado en la amplificación simultánea de marcadores específicos de los patotipos D y ND mediante un protocolo de dúplex-"nested"-PCR. El procedimiento es efectivo en la detección rápida e inequívoca de los patotipos D y ND de V. dahliae, tanto en plantas de vivero inoculadas artificialmente, como en árboles adultos infectados procedentes de plantaciones comerciales; su aplicación a muestras de diverso origen geográfico indicó una alta frecuencia de infecciones por el patotipo D, que concuerda con los informes que alertan a olivicultores sobre la expansión del patotipo más virulento de V. dahliae a nuevas áreas de cultivo.
Asimismo, el procedimiento mejorado permitió constatar que en condiciones naturales se puede dar la coinfección de una planta por los dos patotipos del patógeno, que fue posteriormente corroborada mediante inoculaciones artificiales. Por otro lado, el disponer de los iniciadores específicos y de los procedimientos de detección (protocolos de extracción de ADN y de ensayo PCR), nos ha permitido cuantificar al patógeno en tejidos de olivo infectados. Mediante la tecnología de PCR cuantitativa en tiempo real ("Real-time quantitative PCR"), hemos podido demostrar que la cantidad de ADN de V dahliae presente en diferentes genotipos de olivo infectados está correlacionada en mayor medida con el grado de susceptibilidad de los mismos al patógeno que con la virulencia del patotipo de éste. Por otra parte, la cantidad de ADN del patógeno en tejidos infectados alcanzó su máximo antes de que los síntomas de la enfermedad alcanzaran su máxima expresión en genotipos susceptibles, siendo siempre menor la cantidad de ADN del patógeno en tallos que en raíces. Además, los máximos de ADN de V dahliae (tanto del patotipo D como del ND) en raíces se detectaron desde la primera semana después de la inoculación, pero la cantidad de ADN decreció después de forma paulatina. Nuestros resultados demuestran que la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real es una excelente herramienta tanto para monitorizar la colonización de los tejidos de olivo por V dahliae, como para evaluar la resistencia o tolerancia de genotipos de olivo a la Verticilosis, lo que sería de una inestimable ayuda en programas de mejora de resistencia esta enfermedad.
