Evaluation of cryopreservation methods for a tissue-engineered artificial human oral mucosa model

• Aguilar-Pérez, Silvia ^[1] ; Egea-Marín, Antonia ^[1] ; Chato-Astrain, Jesús ^[1] ; Garzón, Ingrid ^[1] ; Martin-Piedra, Miguel Ángel ^[1]
  1. [1] Universidad de Granada

     Universidad de Granada

     Granada, España

     
• Localización: Actualidad médica, ISSN 0365-7965, T. 111, Nº. 822, 2026, págs. 9-17
• Idioma: inglés
• Títulos paralelos:
  • Evaluación de métodos de criopreservación para un modelo de mucosa oral humana artificial generado por Ingeniería Tisular
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• Resumen
  • español

    Las lesiones de la mucosa oral tienen origen en diversas patologías y su tratamiento consiste en el uso de injertos. Sin embargo, la limitada extensión de la mucosa oral y la escasez de donantes restringen su aplicación. En este contexto, la Ingeniería Tisular surge como una alternativa prometedora, aunque la biofabricación de tejidos artificiales implica extensos protocolos de producción. La criopreservación se plantea como una potencial estrategia para permitir producción, almacenamiento y disponibilidad inmediata de tejidos artificiales. El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de diferentes protocolos de criopreservación sobre un modelo de mucosa oral artificial. Se emplearon sustitutos estromales basados en una matriz de fibrina–agarosa que contenían fibroblastos gingivales humanos, cultivados durante 21 días, y posteriormente sometidos a criopreservación empeando diferentes soluciones crioprotectoras (DMSO 10%, glicerol 10%, trehalosa 0,35 M y CryoStor®), a distintas temperaturas (4, −20 y −80 °C) y por varios periodos de tiempo (7, 15 y 30 días). Como controles se utilizaron constructos no criopreservados y constructos criopreservados en ausencia de agentes crioprotectores. Tras la descongelación, se evaluaron cuatro aspectos clave de la funcionalidad celular: actividad metabólica, proliferación, remodelación de la matriz extracelular y actividad apoptótica, mediante ensayos WST-1, inmunohistoquímicos y TUNEL. Los resultados demostraron que DMSO y CryoStor®, cuando se emplean a temperaturas de congelación, preservan de forma más eficaz la actividad metabólica celular, la capacidad proliferativa y la remodelación de la matriz, manteniendo niveles bajos de muerte celular por apoptosis. Por el contrario, la trehalosa presentó mejores resultados a temperatura de refrigeración (4 °C), lo que indica la relevancia de la temperatura en la eficacia crioprotectora. En conjunto, estos hallazgos subrayan la importancia de optimizar los protocolos de criopreservación para garantizar la preservación de los sustitutos estromales de mucosa oral generados por Ingeniería Tisular, apoyando su potencial uso en tratamientos clínicos.

  • English

    Oral mucosa lesions may arise from a wide range of disorders, and their clinical management is largely based on grafting procedures However, the limited availability of oral mucosa and donor scarcity significantly restricts their application. Tissue Engineering emerges as a promising alternative, although the biofabrication of artificial oral mucosa requires long and complex production protocols. In this context, cryopreservation represents a potential strategy to enable large-scale manufacturing, long-term storage, and immediate availability of tissue-engineered constructs. The aim of this study is to evaluate the effect of different cryopreservation protocols on the cellular functionality of artificial human oral mucosa stroma. Stromal substitutes based on a fibrin–agarose matrix containing human gingival fibroblasts were cultured in vitro for 21 days and subsequently cryopreserved using four different cryoprotective solutions (10% DMSO, 10% glycerol, 0.35 M trehalose and CryoStor®) at different temperatures (4, −20, and −80 °C) for varying storage periods (7, 15, and 30 days). Non-cryopreserved constructs and constructs cryopreserved in a non-cryoprotective solution were used as controls. After thawing and reconditioning, four key aspects of cellular functionality were assessed: metabolic activity, proliferation, extracellular matrix remodeling and apoptotic activity, using WST-1, immunohistochemical and TUNEL assays. The results demonstrated that DMSO and CryoStor® cryoprotective solutions, when applied at freezing temperatures, more effectively preserved cellular metabolic activity, proliferative capacity, and matrix remodeling functions, while maintaining low levels of apoptosis-induced cell death. CryoStor® showed the most consistent protective performance, particularly at −80 °C. In contrast, trehalose yielded better outcomes at refrigeration temperature (4 °C), highlighting the strong temperature dependence of cryoprotective efficacy. Overall, these findings underscore the importance of optimizing cryopreservation protocols to ensure the functional preservation of tissue-engineered oral mucosa stromal substitutes, supporting their potential use as readily available products for clinical applications.