Optimización de la extracción de ácido desoxirribonucleico para la tipificación molecular de antígenos leucocitarios humanos

• Arturo Chang Monteagudo ^[1] ; Luz M Morera Barrios ^[1] ; Catalino R Ustariz García ^[1] ; Antonio Bencomo Hernández ^[1]
  1. [1] Instituto de Hematología e Inmunología
• Localización: Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia, ISSN-e 1561-2996, ISSN 0864-0289, Vol. 31, Nº. 1, 2015
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Optimization of deoxyribonucleic acid extraction for molecular typing of human leukocyte antigens
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    Para la tipificación de los antígenos leucocitarios humanos (HLA) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el método de cebador específico de secuencia (SSP), se necesitan entre 3 y 6 µg de ácido desoxirribonucleico (ADN) de elevada pureza. Se realizó un estudio en el Centro de Ingeniería Celular y Trasplante de Órganos y Tejidos del Instituto de Hematología e Inmunología, para determinar las condiciones y las muestras óptimas para la realización de esta prueba. El ADN se extrajo de muestras de sangre fresca y de sangre total y capa leucocitaria almacenadas en congelación, así como de sangre coagulada y plasma de 15 voluntarios, y de una suspensión de linfocitos. Se utilizó un extractor “QIAcube” y el sistema “QIAamp DNA Blood Mini”. La concentración y pureza del ADN se determinaron mediante un espectrofotómetro de microgotas “EPOCH” con software “Gen 5”. A partir de 200 µL de sangre total y de capa leucocitaria se obtuvieron como promedio 5.8 y 22.4 µg de ADN, respectivamente; sobrepasando siempre los 3 µg. El 100 % de las muestras de plasma y el 6,6 % de sangre coagulada proporcionaron menos de 3 µg. De una suspensión de 30 x 10(6) linfocitos se obtuvieron 40 µg. La razón A260/A280 estuvo siempre entre 1.7 y 2. La sangre total y la capa leucocitaria, tanto frescas como congeladas, rindieron en todos los casos una cantidad óptima de ADN, no así el plasma y la sangre coagulada. La mayor cantidad de ADN se extrajo de una suspensión de linfocitos. Todos los eluatos tuvieron adecuada pureza independientemente del tipo de muestra.

  • English

    For typing the Human Leukocyte Antigens (HLA) by Polymerase Chain Reaction using the Specific Sequence Primer (SSP) method, between 3 and 6 µg of high pureness Deoxyribonucleic Acid (DNA) are needed. In order to establish the best conditions for DNA extraction, as well as the optimal samples, an investigation was carried out in the Center for Cellular Engineering and Organs and Tissues Transplantations in Havana, Cuba. DNA was extracted from fresh and frozen samples of blood, buffy coat, coagulated blood and plasma from 15 volunteers and also extracted from a lymphocyte suspension. A “QIAcube” extractor anda Kit “QIAamp DNA Blood Mini” were used. The DNA concentration and pureness was measured by an “EPOCH” microdot spectrophotometer running “Gen 5” software. From 200 µL of blood or buffy coat means of 5.8 and 22.4 µg of DNA, respectively, were obtained and in all cases the amount of DNA was over 3 µg. One hundred percent of plasma samples and the 6,6 % of coagulated blood samples yielded less than 3 µg of DNA. Forty µg of DNA were extracted from a cell suspension containing 30 x 10(6) lymphocytes. The A260/A280 ratio was between 1.7 and 2 in all eluates. The fresh or frozen blood and buffy coat yielded an optimum amount of DNA in the experiments, but not in plasma nor in coagulated blood. The highest amount of DNA was extracted from a lymphocyte suspension. All eluates were of fine pureness.