Estrategias para la utilización de la bacteria entomopatógena Bacillus Thuringiensis (Berliner) en el control de Ceratitis Capitata (Wiedermann)

Abstract

La mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera:Tephritidae), es considerada la principal plaga de la fruticultura a nivel mundial. Actualmente, la vigencia del control químico como medida prioritaria en el manejo de esta plaga está seriamente comprometida, tanto por restricciones legales (prohibición de materias activas) y sociales (tendencias de consumo) como por limitaciones intrínsecas del método (resistencias). Por ello, el desarrollo e implementación de métodos alternativos de control que sean respetuosos con el medio ambiente adquiere cada vez más importancia. Los productos derivados de Bacillus thuringiensis (Berliner) (Bt) llevan utilizándose con éxito en el control de insectos durante más de medio siglo. El poder insecticida de esta bacteria reside fundamentalmente en un grupo diverso de proteínas denominadas δ-endotoxinas. Existen más de 3000 insectos susceptibles a alguna de estas toxinas, además los productos Bt son altamente selectivos y respetuosos con el medio ambiente. No obstante, hasta el momento no se ha identificado ninguna δ-endotoxina altamente insecticida sobre C. capitata ni sobre otras moscas de la fruta (Tephritidae). La presente tesis doctoral tiene por objeto la evaluación de B. thuringiensis y sus δ- endotoxinas como posibles agentes de control de C. capitata. Para ello, se ha realizado un análisis exhaustivo de la biodiversidad de B. thuringiensis en el agroecosistema citrícola, un hábitat en el que el insecto diana (C. capitata) y el entomopatógeno (B. thuringiensis)han coexistido de forma continuada. La aplicación de diversas técnicas (microscopía, electroforesis de proteínas, detección de genes de δ-endotoxinas) ha demostrado que este agroecosistema es un importante reservorio de B. thuringiensis, tanto por su abundancia como por su diversidad. Sin embargo, ninguno de los aislados de esta colección ni de otras colecciones (en total 905 cepas) muestra alta actividad insecticida sobre C. capitata cuando extractos crudos de su cultivo (esporas y cristales o sobrenadantes) son ensayados. El mecanismo por el cual las δ-endotoxinas son tóxicas sobre las especies susceptibles es complejo y comprende varias etapas: en síntesis, los cristales de δ-endotoxinas tras ser ingeridos se solubilizan en el tracto intestinal dando lugar a protoxinas solubles que son procesadas proteolíticamente por los enzimas digestivos a toxinas activas que, tras atravesar la membrana peritrófica, interactúan con la membrana epitelial desencadenando

una serie de eventos que conducen a la muerte final del insecto. Limitaciones o alteraciones en cada una de estas etapas pueden explicar que una δ-endotoxina particular osea o no propiedades insecticidas sobre una determinada especie de insecto. En este sentido, como reacción a la aparente insensibilidad que muestra C. capitata hacia los cristales de δ-endotoxinas, se ha abordado el tratamiento in vitro de dichos cristales emulando algunos pasos del citado mecanismo de acción así como la evaluación de su actividad biológica sobre C. capitata. Así, la presolubilización de las protoxinas de una selección de 41 cepas de B. thuringiensis y una cepa de Bacillus sphaericus (Meyer y Neide) ha mostrado que para las cepas de una de las subespecies, subsp. israelensis (Bti), este tratamiento produce una ganancia de función biológica sobre las larvas de C. capitata. Es decir, al menos para esta subespecie, la falta de actividad de los cristales de -endotoxinas se debe a su insuficiente solubilización en el tracto intestinal, posiblemente debido a la baja alcalinidad del mismo. Adicionalmente, la predigestión de dichas protoxinas con una fuente exógena de proteasas (extractos de Culex pipiens L., especie susceptible a Bti de forma natural) produce un aumento significativo de su actividad insecticida (CL50 31.26 μg/cm2). Esto sugiere que el procesamiento que sufren las protoxinas de Bti en el intestino de C. capitata tampoco es el adecuado para promover suBti produce una mezcla de 4 protoxinas mayoritarias: Cry4A, Cry4B, Cry11A y Cyt1A. La utilización de una cepa recombinante que produce la protoxina Cyt1Aa individual ha demostrado que esta protoxina es el factor determinante de la actividad que exhibe Bti sobre C. capitata; siendo ésta la primera vez que se identifica una δ-endotoxina única que sea tóxica sobre esta especie. La actividad de Cyt1Aa es la más alta registrada en este estudio (CL50 4.93 μg/cm2), aunque solo cuando sus cristales son previamente solubilizados y únicamente sobre larvas (sobre adultos produce efectos subletales). Esta circunstancia restringe su uso potencial en el control de la plaga. Las toxinas Cyt interactúan directamente con ciertos fosfolípidos de membrana, en cambio las toxinas Cry precisan de receptores específicos en el epitelio intestinal para resultar citotóxicas. Los resultados obtenidos con cepas nativas de B. thuringiensis sugieren que C. capitata carece de los receptores adecuados, al menos para las proteínas Cry ensayadas. Con objeto de salvar esta limitación, esta tesis propone un nuevo método acción citotóxica

basado en el desarrollo de toxinas de fusión en las que la afinidad que de forma natural muestran las toxinas Cry hacia su receptor se sustituya por la fusión a las mismas de anticuerpos que se unan específicamente a proteínas de membrana de C. capitata. Como este método exigiría una intensa labor y supondría un elevado coste económico antes de poder confirmar su viabilidad, se ha puesto en práctica un sistema modelo para evaluar la estrategia propuesta. Los dos elementos clave del sistema modelo son: larvas transgénicas de Drosophila melanogaster (Meigen) que expresan GFP en el epitelio intestinal y proteínas de fusión entre diferentes secciones de la protoxina Cry1Ab y la región variable de un anticuerpo de cadena pesada específico contra GFP (VHH anti-GFP). Se han desarrollado 4 variantes proteicas y se ha determinado el patrón de expresión de GFP en la línea de D. melanogaster; sin embargo, deficiencias en la unión de las toxinas de fusión a su antígeno (GFP) han impedido confirmar por el momento la validez de esta estrategia. Adicionalmente, y en previsión de la potencial aplicación de esta técnica a C. capitata, se ha efectuado una primera prospección de posibles proteínas de membrana candidatas para ser receptores de proteínas de fusión. Existen al menos 160 polipéptidos en la membrana en borde de cepillo del epitelio intestinal de adultos de C. capitata y de las 11 proteínas estudiadas se han identificado al menos 3, V-ATPasa subunidades A y B, y α-tubulina. La idoneidad de éstas u otras proteínas como candidatos para la nueva estrategia deberían evaluarse en futuros estudios. Como conclusión, este trabajo ha identificado una δ-endotoxina de B. thuringiensis, Cyt1Aa, activa contra C. capitata, aunque es necesario valorar su potencial aplicación en el control de esta plaga. Por otro lado, se ha elaborado y caracterizado exhaustivamente una colección de cepas de B. thuringiensis que, si bien muestran poca o ninguna actividad contra la especie diana, poseen un elevado potencial en el control de otras plagas. Por último, a pesar de que la estrategia todavía no ha sido validada, se ha abierto una nueva vía en el desarrollo de toxinas recombinantes para el control de C. capitata u otras plagas de importancia agrícola.