Diseño de vectores basados en genomas de coronavirus: Estabilidad y modulación de la respuesta inmune innata
Author
Bécares Palacios, MartinaEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2015-12-17Subjects
Coronavirus - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 17-12-2015Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Coronaviruses
(CoVs)
are
positive-‐stranded
RNA
viruses
with
potential
as
immunization
vectors,
expressing
high
levels
of
heterologous
genes
and
eliciting
both
secretory
and
systemic
immune
responses.
Nevertheless,
its
high
recombination
rate
may
result
in
the
loss
of
the
foreign
gene,
limiting
their
use
as
vectors.
Transmissible
gastroenteritis
virus
(TGEV)
was
engineered
to
express
porcine
reproductive
and
respiratory
syndrome
virus
(PRRSV)
antigenic
protein
domains.
rTGEV-‐derived
vectors
stability
was
systematically
analyzed
to
determine
the
relevance
of
several
factors,
such
as
protein
domain
size
or
protein
expression
levels,
on
vector
stability.
After
serial
passage
in
tissue
cultures,
stable
expression
of
small
PRRSV
protein
antigenic
domains
was
achieved.
Another
strategy
to
express
antigenic
domains
with
rTGEV-‐derived
vectors
was
the
use
of
PRRSV
M
protein,
whose
expression
with
rTGEV
vectors
was
totally
stable,
as
an
scaffold
to
expose
small
protein
domains.
Both
strategies,
size
reduction
of
the
heterologous
gene
and
using
M
protein
as
an
scaffold,
were
successful
to
obtain
stable
expression
of
the
heterologous
antigens
with
rTGEV-‐derived
vectors.
Immunization
of
piglets
with
these
TGEV
vectors
led
to
partial
protection
against
a
challenge
with
a
virulent
PRRSV
strain,
as
immunized
animals
showed
reduced
clinical
signs
and
lung
damage.
Additionally,
CoV
non
structural
protein
14
(nsp14)
was
studied
as
a
target
to
achieve
vector
attenuation
by
innate
immune
response
modulation.
CoV
nsp14
is
a
60
kDa
protein
encoded
by
the
replicase
gene
that
is
part
of
the
replication-‐transcription
complex.
It
is
a
bifunctional
enzyme
bearing
3'-‐5'
exoribonuclease
(ExoN)
and
guanine-‐N7-‐methyltransferase
(N7-‐MTase)
activities.
ExoN
hydrolyzes
single-‐
and
double-‐stranded
RNAs
and
is
part
of
a
proofreading
system
responsible
for
the
high
fidelity
of
CoV
replication.
Nsp14
N7-‐MTase
activity
is
required
for
viral
mRNA
5’cap
synthesis,
which
is
required
for
protein
translation
and
prevents
the
recognition
of
viral
mRNAs
as
“non-‐self”
by
the
host
cell.
A
set
of
mutants
affecting
different
nsp14
domains
was
generated,
using
TGEV
as
a
model
of
Alphacoronavirus.
Most
of
the
mutants
showed
defects
in
RNA
synthesis,
with
a
moderate
decrease
of
the
replication
levels
and
a
strong
to
total
reduction
of
transcription
levels,
confirming
the
essential
role
of
nsp14
protein
during
CoV
RNA
synthesis.
Mutants
lacking
ExoN
activity
were
non-‐viable
despite
being
competent
in
both
viral
RNA
and
protein
synthesis.
The
mutant
lacking
N7-‐MTase
activity
was
recovered,
although
revertants
were
rapidly
imposed
within
the
population.
A
specific
mutation
within
the
zinc
finger
1
(ZF-‐C)
led
to
a
viable
virus
with
growth
and
viral
RNA
synthesis
kinetics
similar
to
that
of
the
parental
virus.
Mutant
rTGEV-‐ZF-‐C
virus
caused
decreased
cytopathic
effect
and
apoptosis
compared
with
the
wild-‐type
virus,
and
reduced
levels
of
dsRNA
accumulation
at
late
times
post-‐infection.
Consequently,
the
mutant
triggered
a
reduced
antiviral
response,
which
was
confirmed
by
evaluating
different
stages
of
the
dsRNA-‐induced
antiviral
pathway.
The
expression
of
IFN-‐β,
TNF,
and
interferon-‐stimulated
genes
in
cells
infected
with
mutant
rTGEV-‐ZF-‐C
was
reduced
when
compared
to
the
parental
virus.
Overall,
these
data
revealed
a
new
role
for
CoV
nsp14
in
modulation
of
the
innate
immune
response Los
coronavirus
(CoVs)
son
virus
con
un
genoma
de
RNA
de
cadena
sencilla
y
polaridad
positiva.
Estos
virus
son
prometedores
sistemas
de
expresión
de
genes
heterólogos
para
su
uso
como
vectores
vacunales
dado
que
expresan
altos
niveles
de
las
proteínas
heterólogas
y
promueven
inmunidad
secretora
y
sistémica.
Sin
embargo,
su
uso
se
ve
limitado
por
la
alta
tasa
de
recombinación
en
CoVs,
que
causa
inestabilidad
en
los
vectores,
resultando
en
la
pérdida
de
los
genes
heterólogos.
El
virus
de
la
gastroenteritis
porcina
transmisible
(TGEV)
se
usó
como
vector
para
la
expresión
de
dominios
antigénicos
de
proteínas
del
virus
del
síndrome
reproductivo
y
respiratorio
porcino
(PRRSV).
La
estabilidad
de
estos
vectores
se
analizó
sistemáticamente
para
determinar
la
relevancia
en
la
estabilidad
del
vector
de
factores
como
el
tamaño
del
inserto
heterólogo
o
los
niveles
de
expresión
de
la
proteína.
Se
consiguieron
vectores
estables
que
expresaban
dominios
antigénicos
de
pequeño
tamaño
de
las
proteínas
del
PRRSV.
Asimismo,
se
utilizó
la
proteína
M
del
PRRSV,
cuya
expresión
con
vectores
basados
en
el
genoma
del
TGEV
fue
totalmente
estable,
como
matriz
para
la
exposición
de
pequeños
dominios
antigénicos.
La
reducción
en
el
tamaño
del
inserto
heterólogo
y
el
empleo
de
la
proteína
M
del
PRRSV
como
matriz
resultaron
estrategias
útiles
para
la
obtención
de
vectores
estables
basados
en
el
genoma
del
rTGEV.
La
inmunización
de
lechones
con
estos
vectores
indujo
protección
parcial
frente
a
los
signos
clínicos
de
la
enfermedad
después
del
desafío
con
una
cepa
virulenta
del
PRRSV.
Por
otra
parte,
la
proteína
no
estructural
14
(nsp14)
se
estudió
como
posible
diana
para
la
atenuación
y
modulación
de
la
respuesta
inmune
innata
de
los
vectores
derivados
de
CoVs.
La
proteína
nsp14,
codificada
en
el
gen
de
la
replicasa,
es
una
proteína
de
60
KDa
que
forma
parte
del
complejo
de
replicación-‐transcripción.
La
proteína
nsp14
es
bifuncional,
con
actividad
exonucleasa
(ExoN)
y
guanina-‐
N7-‐metiltransferasa
(N7-‐MTasa).
La
actividad
ExoN
hidroliza
RNA
de
cadena
sencilla
y
doble,
y
actúa
como
sistema
de
corrección
de
errores,
responsable
de
la
alta
fidelidad
de
la
replicación
de
CoVs.
La
actividad
N7-‐MTasa
está
implicada
en
la
síntesis
del
5’cap,
requerido
para
la
traducción
y
para
evitar
la
activación
de
la
respuesta
antiviral.
Se
generó
un
conjunto
de
mutantes
en
distintos
motivos
de
la
proteína
nsp14
de
TGEV,
como
modelo
de
Alfacoronavirus.
La
mayoría
de
los
mutantes
generados
mostraron
defectos
en
la
síntesis
de
RNA,
con
una
reducción
moderada
de
la
replicación
y
drástica
en
transcripción,
confirmando
un
papel
esencial
de
la
nsp14
en
la
síntesis
de
RNA
en
CoVs.
Los
mutantes
que
carecían
de
actividad
ExoN
no
fueron
viables,
a
pesar
de
sintetizar
RNAs
y
proteínas
virales.
El
mutante
sin
actividad
N7-‐MTasa
se
rescató,
aunque
rápidamente
aparecían
revertientes
que
se
imponían
en
la
población.
Una
mutación
en
el
motivo
zinc
finger
1
(ZF-‐C)
produjo
un
virus
viable
con
cinéticas
de
crecimiento
y
síntesis
de
RNA
similares
a
las
del
virus
silvestre.
El
virus
mutante
rTGEV-‐ZF-‐C
producía
un
efecto
citopático
y
apoptosis
menores
que
los
del
virus
parental.
La
acumulación
de
RNA
de
doble
cadena
(dsRNA)
en
la
infección
con
el
virus
rTGEV-‐ZF-‐C
fue
significativamente
menor
que
en
el
caso
del
virus
parental,
y
por
consiguiente
inducía
una
reducida
respuesta
antiviral.
La
evaluación
de
diversas
etapas
de
la
respuesta
antiviral
mostró
que
la
expresión
de
IFN-‐β,
TNF,
y
genes
estimulados
por
interferón
(ISGs)
era
menor
en
las
células
infectadas
con
el
rTGEV-‐ZF-‐C,
en
comparación
con
el
virus
silvestre.
En
conjunto,
los
datos
obtenidos
indicaron
que
la
proteína
nsp14
tiene
una
función
adicional
en
la
modulación
de
la
respuesta
inmune
innata
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