Tolerancia al estrés por cadmio y mercurio en Medicago spp: Análisis de los mecanismos implicados y potencial aplicación en fitorremediación
Entity
UAM. Departamento de Biología; CSIC. Instituto de Ciencias Agrarias (ICA)Date
2015-02-13Subjects
Fitorremediación - Tesis doctorales; Suelos - Contaminación - Tesis doctorales; Plantas, Efectos de la contaminación sobre las - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de lectura: 13-02-2015Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
El cadmio (Cd) y el mercurio (Hg) son dos de los elementos más tóxicos liberados al medio
ambiente, constituyendo un grave riesgo para los ecosistemas y la salud humana. La
fitorremediación es una tecnología emergente que pretende solventar problemas de
contaminación mediante el uso de plantas, de manera económica y respetuosa con el medio
ambiente, aunque todavía presenta algunas limitaciones, como es la identificación de variedades
tolerantes y el conocimiento de los mecanismos que gobiernan la tolerancia y acumulación de
metales pesados en plantas. Medicago truncatula es una leguminosa forrajera de rápido
crecimiento y considerable biomasa pudiendo constituir una buena candidata para su uso en
fitorremediación. En esta Tesis Doctoral se analizó la tolerancia a Hg y Cd en 258 cultivares de
M. truncatula. Para ello se desarrolló un método de screening mediante un sistema hidropónico
miniaturizado, utilizando el crecimiento relativo de la raíz (RRG) en plántulas como indicador
de la tolerancia. El screening fue posteriormente validado en sobres de crecimiento hidropónico
con la determinación de diversos parámetros morfométricos. Se identificaron cuatro cultivares
tolerantes a Hg y tres cultivares tolerantes a Cd con potencial aplicación en fitoextración y/o
fitoestabilización. Por otro lado, se estudiaron los mecanismos de respuesta y tolerancia a Cd en
dos cultivares de M. truncatula, uno tolerante a Cd (CdT) y otro sensible (CdS), en diferentes
estadios de desarrollo. El cultivar CdT mostró mejor respuesta frente al estrés por Cd que el
cultivar sensible, con una germinación y movilización de reservas de la semilla más eficiente,
una buena defensa antioxidante y menor daño oxidativo, tanto en plántula como en planta de 15
días. El cultivar CdS no fue capaz de controlar la acumulación de ROS con la primera barrera
antioxidante y, aunque se indujo la biosíntesis de glutatión y de fitoquelatinas en plántulas, no
fue suficiente para tolerar los niveles de estrés impuestos. También se estudió la función de la
prolina en la tolerancia a Cd, utilizándose una línea transgénica de M. truncatula que
sobreexpresa el gen Δ1-pirrolina-5-carboxilato sintetasa de Vigna aconitifolia (VaP5CS) y
acumula prolina. Los resultados demostraron que la expresión de VaP5CS y la consecuente
acumulación de prolina durante la exposición al Cd mejoraron la germinación, el estado
fisiológico y la defensa antioxidante en diferentes estadios de desarrollo (plántula y planta de 32
días), además de atenuar el daño oxidativo. Para profundizar en los mecanismos de regulación
postranscripcional en respuesta a Cd, en los cultivares CdT y CdS se estudió la expresión de
varios miRNAs, identificados en ápices de raíz de M. truncatula sometida a diferentes estreses.
Tres de los miRNAs analizados mostraron diferencias de expresión entre ambos cultivares. Se
estudió en mayor detalle el papel del miRNA nmiR3, cuya expresión fue superior en el cultivar
sensible y reguló negativamente la expresión varios genes implicados en el estrés por metales.
Además, se obtuvieron raíces transformadas de M. truncatula, observándose que la inhibición
de este miRNA disminuía el efecto dañino del Cd, mientras que su sobreexpresión tenía un
efecto negativo en las raíces sometidas a estrés por Cd Cadmium and mercury are two of the most toxic compounds released to the environment,
and pose a major risk to the ecosystems as well as to human health. Phytoremediation is an
emergent technology that attempts to clean up polluted soils through the use of plants in an
inexpensive and environmentally friendly manner. However, this approach presents some
limitations, such as the identification of tolerant varieties and the knowledge of the mechanisms
that govern heavy metal tolerance and accumulation. Medicago truncatula is a forage
leguminous plant with a fast growth, high biomass production, which can be considered a
promising candidate to be used in phytoremediation approaches. In this Thesis, Hg and Cd
tolerance was analysed in 258 M. truncatula cultivars. A miniaturized hydroponic system was
developed as screening method using the relative root growth (RRG) to assess metal tolerance at
the seedling stage. The screening method was validated in growth pouches with the
determination of several morphometric parameters. Four cultivars were identified as Hg tolerant
and three cultivars were identified as Cd tolerant, with potential application in phytoextraction
and/or phytostabilization. Cadmium toxicity and tolerance mechanisms were further
investigated in two M. truncatula cultivars, one tolerant (CdT) and one sensitive (CdS) to this
metal, at different developmental stages. The CdT cultivar showed a better response to cope
with Cd, with an improved germination and efficient reserves mobilization in germinating
seeds, a good antioxidant defence and lower oxidative damage in seedlings and in 15 day-old
plants. The CdS cultivar could not handle the ROS accumulation using the primary antioxidative
barrier. Although glutathione and phytochelatin biosynthesis were promoted at the seedling
stage, it was not sufficient to elude the imposed stress. In addition, the function of proline in Cd
tolerance was studied in a transgenic M. truncatula line (M. truncatula p18) overexpressing Δ1-
pirroline-5-carboxilate sintetase (P5CS) from Vigna aconitifolia, which leads to proline
accumulation. The results demonstrated that overexpression of VaP5CS and the subsequent
proline accumulation during the Cd treatment improved germination, physiological state and
antioxidant defence, and reduced oxidative damage at different developmental stages (seedlings
and 32 day-old plants). To further analyse the posttranscriptional regulation mechanisms in
response to Cd stress, the expression patterns of several miRNAs, previously identified in M.
truncatula root tips submitted to different stresses, were analysed in cultivars CdT and CdS.
Some of the miRNAs showed differential expression patterns between the cultivars. The role of
nmiR3 was further investigated. Its expression was higher in the sensitive than the tolerant
cultivar, and it negatively regulated some genes involved in metal stress response. In addition,
the inhibition of this miRNA in M. truncatula transgenic roots decreased the detrimental effect
of Cd, and conversely, its overexpression increased the harmful effects of the heavy metal in the
transgenic roots.
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