Caracterització funcional d'elements conservats de la via Wnt en la regeneració cefàlica de planàries

Abstract

La comunicación entre células es esencial para integrar las órdenes necesarias para que un organismo pueda desarrollarse correctamente desde el estadio de una célula hasta el mantenimiento del estado adulto. El número de vías de señalización que las células necesitan para comunicarse es relativamente bajo y por ello dichas vías se reutilizan varias veces durante el desarrollo de los organismos. El organismo modelo empleado en este trabajo es la planaria de agua dulce <I>Girardia tigrina</I>. Las planarias son especialmente interesantes por su gran plasticidad morfológica y gran habilidad para regenerar las partes perdidas del cuerpo. Con esta tesis se intenta dilucidar el papel en la regeneración de una vía de proteínas señalizadoras en particular, la vía Wnt, que rige múltiples funciones durante el desarrollo normal de los organismos. En concreto se describe el aislamiento de un homólogo de la subfamilia Wnt-5, del regulador negativo de la vía, la GSK-3 (glicógeno sintasa quinasa-3), y de uno de los efectores nucleares de la familia TCF (T-cell factor). Asímismo se analiza el patrón de expresión de los dos primeros, hallándose un máximo en el sistema nervioso central. Además, se detallan experimentos de RNA de interferencia realizados por distintas metodologías para provocar fenotipos de pérdida de función. Estas metodologías consistieron por un lado en la inyección de RNA de doble cadena diseñado a partir del gen que específicamente se pretendía bloquear y, por otro lado, en la ingestión de bacterias que expresaban la doble cadena de RNA del gen en cuestión. Dichas aproximaciones fueron exitosas para el gen GSK-3, con resultados corroborados con drogas inhibidoras para dicha quinasa. Para el ligando Wnt-5 no se obtuvo fenotipo de falta de función, hipotetizándose así una posible redundancia entre posibles distintos Wnt existentes en planaria. Los fenotipos de pérdida de función de GSK-3, en cambio, indican un papel esencial para este gen en la regeneración de la parte más anterior del organismo y en la determinación cefálica.

<i>DOCTORAL THESIS: "FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF CONSERVED ELEMENTS OF THE WNT PATHWAY IN THE CEPHALIC REGENERATION OF PLANARIANS"<br/><br/>Communication between cells is essential to integrate the orders that an organism needs to develop properly from a one-cell stage to the maintenance of the adult stage. The number of signalling pathways that cells use to comunicate to each other is relatively low, therefore these cascades are re-used several times during development of organisms. The model system in this work has been the fresh-water planarian, Girardia tigrina. Planarians are specially interesting for their high morphological plasticity and huge hability to regenerate lost parts of the body. With this doctoral thesis, we have tried to elucidate the role during regeneration of a particular signalling pathway, the Wnt pathway, which drives multiple functions during normal development of organisms both at early and late stages. More precisely, we describe the isolation of a Wnt-5 ligand, as well as the negative regulator of the pathway, GSK-3 (glycogen synthase kinase-3), and an homologue of a nuclear transciptional factor, TCF-4 (T-cell factor-4). The expression patterns are also analyzed and a maximum is found at the central nervous system, at least for the two first genes. Besides, we show different RNAinterference experiments performed by two methods to acquire loss of function phenotypes. One of the techniques consisted of the injection of double-strand RNA specific for the gene we wanted to knock-down and the other consisted of the ingestion of bacterially expressed double-strand RNA of the gen. Both approaches were succesful for the GSK-3 homologue, giving rise to similar results that had been obtained with drugs against the same kinase. However, no loss of function phenotypes were obtained with RNAi for Wnt-5, so the hypothesis was redundancy with other Wnt members possibly present in the planarian genome. Instead, GSK-3 loss of function phenotypes indicate an essential role for this enzyme in regeneration of the most anterior part of the organism and in the cephalic determination. </I>