High-density bacterial immobilization strategies for the development of microbial biosensors

Abstract

Els biosensors microbians són dispositius analítics que utilitzen microorganismes com elements de reconeixement. Els microorganismes s’immobilitzen a la superfície del transductor de manera que la interacció microorganisme-analit genera una senyal (electroquímica, òptica, entre altres) que pot ser quantificada. Els biosensors microbians es poden fer servir en diferents àmbits d’aplicació com al diagnòstic clínic, la indústria alimentària o la monitorització mediambiental amb l’avantatge de ser portables, simples, barats, i per tant bones alternatives als mètodes de laboratori. Desafortunadament, el desenvolupament de biosensors microbians es veu obstaculitzat per: (i) la baixa reproductibilitat que presenten els protocols d’immobilització de les cèl·lules, (ii) la seva poca sensibilitat, deguda a la dificultat d’immobilitzar elevades concentracions de microorganismes, i (iii) la curta vida útil dels mateixos, deguda a la mort cel·lular durant el procés d’immobilització o emmagatzematge.

Aquesta tesi descriu el desenvolupament de dues estratègies d’immobilització que permeten el confinament reproduïble de microorganismes a la superfície d’un elèctrode, amb elevades densitats i de manera reproduïble, i al mateix temps proporciona un entorn fisiològic que permet una adequada difusió dels nutrients, garantint la funcionalitat i la viabilitat dels microorganismes atrapats.

En la primera estratègia, les cèl·lules microbianes romanen atrapades en una matriu polimèrica d’alginat-grafit electrodepositada a la superfície de l&#8216;elèctrode mitjançant condicions molt suaus i fisiològiques (temperatura ambient, medi aquós, pH neutre…) de polimerització. Els elèctrodes recoberts d’alginat conductor s’obtenen després de l’electrodeposició potenciostàtica de mostres d’alginat dopades amb grafit (fins al 4% de grafit). La presència de grafit redueix la passivació de l’elèctrode i millora la resposta electroquímica dels sensors recoberts d’alginat. L’atrapament de microorganismes és molt eficient (4.4x107 cèl·lules per elèctrode) i reproduïble (CV <0.5%), sense comprometre la integritat ni l’activitat microbiana.

En la segona estratègia, els microorganismes romanen atrapats en la matriu de polietersulfona, un material soluble en solvents orgànics que precipita en contacte amb medis aquosos en un procés anomenat inversió de fase. Hem demostrat que els microorganismes poden incorporar-se durant la formació de la membrana mantenint certa viabilitat. Amb aquest mètode, s’obtenen de manera reproduïble membranes de 300 µm amb 2.6x106 cèl·lules en el seu interior, que mantenen nivells acceptables d’integritat i viabilitat cel·lular.

Tots dos sistemes s’han utilitzat per immobilitzar E. coli a la superfície d’elèctrodes serigrafiats per desenvolupar biosensors, en els quals, els microorganismes actuen com a elements de reconeixement. La biodetecció s’ha realitzat electroquímicament mitjançant la respirometria de ferricianur, de manera que els microorganismes atrapats dins de la matriu poden reduir el ferricianur en presència de glucosa i convertir-lo en ferrocianur. S’ha avaluat el rendiment analític dels dos biosensors microbians amperomètrics portant a terme un assaig de toxicitat utilitzant 3,5-diclorofenol (DCP) com a compost tòxic model. En tots dos casos, els biosensors van proporcionar una resposta depenent de la concentració de DCP, amb una dosi efectiva (EC50) de 3.5 ppm (alginat) i 9.2 ppm (polietersulfona), d’acord amb els valors reportats. Aquestes metodologies d’atrapament són susceptibles de producció en massa perquè permeten una producció fàcil i repetitiva de biosensors microbians robusts amb una bona sensibilitat.

Los biosensores microbianos son dispositivos analíticos que utilizan microorganismos como elementos de reconocimiento. Los microorganismos están inmovilizados en la superficie del transductor de manera que la interacción microorganismo-analito genera una señal (electroquímica, óptica, entre otras) que puede ser cuantificada. Los biosensores microbianos se pueden aplicar en diferentes campos como el diagnóstico clínico, la industria alimentaria o la monitorización medioambiental, con la ventaja de ser portables, simples, baratos, así como una buena alternativa a los métodos de laboratorio. Desafortunadamente, la implementación de los biosensores microbianos se ha visto obstaculizada por: (i) su pobre reproducibilidad, debido a la poca reproducibilidad de los protocolos de inmovilización de las células, (ii) su poca sensibilidad, por la dificultad de inmovilizar elevadas concentraciones de microorganismos, y (iii) su corta vida útil, debido a la muerte celular durante el proceso de inmovilización o almacenamiento.

Esta tesis describe el desarrollo de dos estrategias de inmovilización que permiten el confinamiento reproducible de microorganismos en la superficie del electrodo, con altas densidades y de manera reproducible, al tiempo que proporcionan un entorno fisiológico que permite una adecuada difusión de nutrientes, asegurando la funcionalidad y viabilidad de los microorganismos atrapados.

En uno de los sistemas, las células microbianas se atrapan en una matriz polimérica de alginato-grafito electrodepositada en la superficie del electrodo utilizando condiciones muy suaves y fisiológicas (temperatura ambiente, medio acuoso, pH neutro…). Los electrodos recubiertos de alginato conductor se obtienen después de la electrodeposición potenciostática de muestras de alginato dopadas con grafito (hasta el 4% de grafito). La presencia de grafito reduce la pasivación del electrodo y mejora la respuesta electroquímica de los sensores recubiertos de alginato. El atrapamiento de microorganismos es altamente eficiente (4.4x107 células por electrodo) y reproducible (CV <0.5%) sin comprometer la integridad o actividad microbiana.

En la segunda estrategia, los microorganismos quedan atrapados en una matriz de polietersulfona, un material soluble en solventes orgánicos y que sólo precipita en contacto con medio acuoso en un proceso llamado de inversión de fase. Hemos demostrado que los microorganismos pueden incorporarse durante la formación de la membrana manteniendo cierta viabilidad. Con este método, se obtuvieron de manera reproducible membranas de 300 µm, con 2.6x106 células en su interior, que mantienen niveles aceptables de integridad y viabilidad celular.

Ambos sistemas se han utilizado para inmovilizar E.coli en la superficie de electrodos serigrafiados para desarrollar biosensores en los que los microorganismos actúan como elementos de reconocimiento. La biodetección se ha realizado electroquímicamente mediante respirometría de ferricianuro, de manera que los microorganismos atrapados dentro de la matriz pueden reducir el ferricianuro en presencia de glucosa y convertirlo en ferrocianuro. Se ha evaluado el rendimiento analítico de los dos biosensores microbianos amperométricos llevando a cabo un ensayo de toxicidad utilizando 3,5-diclorofenol (DCP) como compuesto tóxico modelo. En ambos casos, los biosensores proporcionaron una respuesta dependiente de la concentración de DCP con una dosis efectiva (EC50) de 3.5 ppm (alginato) y 9.2 ppm (polietersulfona), de acuerdo con los valores reportados. Esta metodología de atrapamiento es susceptible a la producción en masa porque permite una producción fácil y repetitiva de biosensores microbianos robustos con buena sensibilidad.

Microbial biosensors are analytical devices that use microorganisms as recognition elements. Microorganisms are immobilized on the surface of a transducer in such a way that the microorganism-analyte interaction generates a signal (electrochemical, optical, among others) that can be quantified. These microbial biosensors can be applied in the fields of clinical, industrial or environmental diagnosis with the advantage of being portable, simple and inexpensive alternatives to many laboratory-based methods. Unfortunately, development of microbial biosensors has been hindered by important technical limitation related to: (i) poor reproducibility, due to non-reproducible cell immobilization protocols, (ii) low sensitivity, by the difficulty of immobilizing high bacterial concentrations, and (iii) short life-time, due to cell death during immobilization or storage.

This thesis describes the development of two immobilization strategies that allow reproducible confinement of microorganisms at the electrode surface, with high densities and in a reproducible manner, while providing a physiological environment that allows adequate diffusion of nutrients, ensuring the functionality and viability of the trapped microorganisms.

In one of the strategies, (1) microbial cells have been trapped in an alginate-graphite polymeric matrix electrodeposited at the electrode surface using very soft and biocompatible conditions (i.e. room temperature, aqueous medium, neutral pH, etc.). Conductive alginate-coated electrodes are obtained after potentiostatic electrodeposition of graphite-doped alginate samples (up to 4% graphite). The presence of graphite reduces electrode passivation and improves the electrochemical response of alginate-coated sensors. Bacterial entrapment in the conductive matrix is highly efficient (4.4x107 cells per electrode), reproducible (CV < 0.5%) and does not compromise bacterial integrity or activity.

In the second strategy, (2) microorganisms are trapped in polyethersulfone when the polymer, initially dissolved in organic solvents, precipitates in aqueous medium through a process of phase inversion. We have shown that microorganisms can be incorporated during membrane formation and remain viable. With this method, 300 µm PES membranes were reproducibly obtained containing up to 2.3x106 cells per electrode, with an entrapment efficiency of 8.2%, while maintaining acceptable levels of cell integrity or viability.

Both systems have been applied to immobilize E. coli at the surface of screen-printed electrodes to develop biosensors in which microorganisms act as recognition elements. Biosensing has been performed electrochemically through ferricyanide respirometry, with metabolically-active entrapped bacteria reducing ferricyanide in the presence of glucose. The analytical performance of the two amperometric microbial biosensors has been assessed carrying out a toxicity assay using 3,5-dichlorophenol (DCP) as a model toxic compound. In both cases, biosensors provided a concentration-dependent response to DCP with half-maximal effective concentration (EC50) of 3.5 ppm (alginate) and 9.2 ppm (polyethersulfone), well in agreement with reported values. This entrapment methodology is susceptible of mass production and allows easy and repetitive production of robust and sensitive microbial biosensors.