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Ingeniería de biocatalizadores inmovilizados de lipasas: captura de agregados bimoleculares por técnicas de inmovilización
Author
Mamede, Rita PestanaAdvisor
Guisán Seijas, José ManuelEntity
UAM. Departamento de Química Física Aplicada; CSIC. Instituto de Catálisis y Petroleoquímica (ICP)Date
2021-06-10Subjects
Lipasa - Enzimas - Tesis Doctoral; Física; QuímicaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Química Física Aplicada. Fecha de Lectura: 10-06-2021Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es estudiar la relación entre las diferentes estrategias de inmovilización de lipasas y las propiedades de los diferentes derivados obtenidos: actividad, estabilidad, selectividad.
Inicialmente observamos que a concentraciones moderadamente altas de lipasas (p.e. 2 mg/mL) las enzimas solubles se encuentran mayoritariamente como agregados bimoleculares de dos estructuras abiertas de la enzima.
A partir de este resultado desarrollamos estrategias para inmovilizar la forma abierta y la forma cerrada de la lipasa de Thermomyces lanuginosus (TLL). La forma abierta se inmovilizó por adsorción interfacial sobre soportes hidrofóbicos, por adsorción iónica del agregado bimolecular y por inmovilización covalente del agregado bimolecular. La forma cerrada se inmovilizó covalentemente en presencia del surfactante CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio).
Todos los derivados de las formas abiertas eran bastante más estables que el derivado de la forma cerrada. El derivado más interesante (adsorción hidrofóbica más recubrimiento con polialilamina) era 10 veces más activo que la enzima soluble diluida y 1800 veces más estable en experimentos de inactivación térmica.
Diseñamos una nueva estrategia para fijar e inmovilizar selectivamente los agregados bimoleculares de TLL y de otras lipasas (Cándida antárctica fracción B, Rhizomucor miehie, Lecitase). En todos los casos, los derivados de los agregados eran bastante más estables que el derivado de la forma cerrada. El derivado más estable era el de la Lecitase que 100 veces más estable que el derivado de la Lecitasa cerrada. The main objective of this Ph.D. Thesis is the study of the relationship between different strategies for immobilization of lipases and the properties of the different derivatives. Firstly, it was observed that, by using moderate or high concentrations of soluble lipases (e.g., 2 mg/mL), the soluble enzymes are mainly forming bimolecular enzyme aggregates of two open structure of the lipases.
From these results, different strategies for the immobilization of the open and closed structure of Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) were developed. The open structure was immobilized by adsorption of the isolated enzyme on hydrophobic supports, by ionic adsorption of the bimolecular aggregate on anionic exchangers and by covalent immobilization of bimolecular aggregates. The closed structure of TLL was immobilized by covalent immobilization of the isolated enzyme in the presence of CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide).
All immobilized derivatives of the open structure of TLL were much more stable than the derivative of the isolated closed enzyme. The most interesting derivative (hydrophobic adsorption plus coating with poly-allyl-amine) was 10 fold more active (intrinsic activity) tan the diluted soluble enzyme and 1800 fold more stable in experiments of thermal inactivation.
Finally, a new strategy for selective fixation and immobilization of bimolecular lipase aggregates was developed. TLL and other lipases were studied (Candida antarctica fraction B, Rhizomucor miehei, Lecitase). In all cases, these derivatives were quite more stable than the derivative of isolated closed enzyme. Bimolecular Lecitase was 100 fold more stable than the isolated closed enzyme.
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