Coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio: patología y protección
Entity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2020-02-21Subjects
Coranovirus - Patologías - Tesis doctorales; Coranovirus - Protección - Combinación de medicamentos - Tesis doctorales; Coranovirus - Curación - Vacunas - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 21-02-2020Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 21-08-2021
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
El coronavirus (CoV) del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) es un
virus emergente que representa una grave amenaza para la salud humana. Actualmente, no
existen terapias o vacunas aprobadas frente al MERS-CoV. Los objetivos de esta tesis se han
centrado en la obtención de anticuerpos de distinta naturaleza y especificidad, y vacunas
basadas en virus atenuados o replicones RNA (RR), para la prevención y el tratamiento de
las infecciones por el MERS-CoV.
Se ha evaluado in vivo la protección conferida por varios anticuerpos monoclonales
humanos (mAbs, 150 kDa) específicos para tres dominios de la proteína de las espículas (S).
Los mAb, específicos para el dominio de unión al receptor (RBD) proporcionaron una
protección del 80-100%, los específicos para el dominio de fusión de membranas (FD)
protegieron al 100% de los animales infectados, y los específicos para el dominio de unión a
ácido siálico (S1A) dieron una menor protección (40%), ilustrando los diferentes niveles de
protección conferidos por los distintos mAbs en función de la especificidad de cada uno.
Así mismo, se evaluó in vivo un nanoanticuerpo (VHH, 15 kDa) de dromedario y un
anticuerpo de cadena pesada (HCAb 78 kDa) quimérico de dromedario/humano, ambos
específicos para el RBD. El HCAb mostró una actividad neutralizante muy alta in vivo y
protección completa en la infección por el MERS-CoV comparado con los mAbs
convencionales. Sin embargo, el VHH no protegió in vivo, a pesar de su capacidad de
neutralizar al MERS-CoV en cultivos celulares.
Para el diseño de vacunas específicas para el MERS-CoV se han generado clones
cDNA infectivos del MERS-CoV que han permitido la construcción de dos tipos de vacunas
mediante un sistema de genética reversa del MERS-CoV. El primer tipo de vacunas atenuadas
consiste en una colección de seis mutantes del MERS-CoV en los que se han introducido
deleciones de 9-11 aminoácidos a lo largo del extremo C-terminal de la proteína E (MERSCoV-
E*). Tres de estos mutantes (E*-Δ1, E*-Δ2, y E*-mutPBM) se seleccionaron para
posteriores análisis. El mutante E*-Δ2 se estabilizó mediante la incorporación espontánea de
cinco aminoácidos a continuación de la deleción introducida (E*-Δ2in). Los ratones infectados
con el mutante E*-Δ1 perdieron peso y murieron. Por el contrario, los mutantes E*-Δ2in y E*-
mutPBM estaban atenuados y proporcionaron protección completa frente al MERS-CoV
virulento.
El segundo tipo de vacunas se basó en la deleción completa del gen E del virus, dando
lugar a un RR de ciclo único (MERS-CoV-ΔE). Este RR se amplificó en células
empaquetadoras que suplementaban la proteína E en trans. Para incrementar la seguridad
del RR, se delecionaron distintas combinaciones de genes accesorios del MERS-CoV
implicados en el antagonismo de la respuesta de interferón. En uno de los RR se delecionaron
simultáneamente 5 genes (MERS-CoV-Δ[3,4a,4b,5,E]). Los ratones inmunizados con todos
los RRs generados proporcionaron protección completa frente a una dosis letal del MERSCoV.
Las vacunas generadas están basadas en replicones que no se propagan de célula a
célula, por lo que se consideran altamente bioseguras. There are no approved vaccines or treatments against the Middle East respiratory
syndrome coronavirus (MERS-CoV), a life-threating emergent virus. The objectives of this
thesis were the development of antibodies and vaccines for the prevention and treatment of
MERS-CoV infection.
In this thesis we have evaluated in vivo different human monoclonal antibodies (mAb)
(specific for different domains of the spike protein, S). The mAb specific for the receptor biding
motif (RBD) conferred 80-100% of protection. Interestingly, those specific for the fusion domain
(FD) and those for the sialic acid domain (S1A) conferred 100% and 40% of protection
respectively, illustrating the different protection levels granted by the different mAbs depending
on the specificity of each one.
In addition, we evaluated one dromedary nanobody (VHH) and one heavy-chain chimeric
dromedary/human antibody (HCAb), both specific for the RBD. HCAb has demonstrated in
vivo a potent neutralizing activity compared with conventional mAbs. Despite its neutralization
capacity in cell cultures, the VHH did not confer any protection in vivo.
Despite the concerns about its safety, attenuated vaccines have proven its potential to
induce strong and lasting immune responses. It has been described in our laboratory that the
severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) envelope (E) protein is a
virulence factor. Based on this knowledge, we have generated two types of vaccines for
MERS-CoV using a reverse genetics system. The first one was based in the generation of a
collection of six mutants carrying small deletions spanning the C-terminal domain of the E
protein (rMERS-CoV-E*). Two out of them (E*-Δ2, and E*-mutPBM) were initially selected for
further analysis because they provided protection. Finally, vaccine E*-Δ2 was stabilized by
introducing five amino acids within the engineered deletion (E*-Δ2in), provided full protection
and was selected for in vivo application, were it demonstrated full protection in a challenge
against virulent MERS-CoV.
The second type of vaccine was based on the full deletion of the envelope (E) protein
(rMERS-CoV-ΔE), which resulted in a replication-competent and propagation-defective onecycle
virus: an RNA replicon. This replicon was amplified using a packaging cell line that
provided the E protein in trans. In order to increase replicon safety, accessory MERS-CoV
genes were also deleted, leading to the generation of three different RNA replicons. The
attenuation of these replicons was evaluated in vivo. Mice immunized with the RNA replicons
were challenged with a lethal dose of MERS-CoV. All the immunized mice survived, and
showed significant weigh loses or clinical sings.
Among the two types of vaccine candidates generated, the most promising is the
replicon, due to its strong attenuation and its capacity to replicate but not to propagate.
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Description
Texto de la Tesis Doctoral
Google Scholar:Gutiérrez Álvarez, Francisco Javier
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