Contribución de RNAs no codificantes pequeños del hospedador y del virus a la patología pulmonar inflamatoria causada por el coronavirus del síndrome respiratorio agudo y grave
Entity
UAM. Departamento de Biología Molecular; CSIC. Centro Nacional de Biotecnología (CNB)Date
2017-06-30Subjects
Aparato respiratorio - Enfermedades - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 30-06-2017Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 30-12-2018
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) causes lethal disease in
humans, which is characterized by exacerbated inflammatory response and extensive
lung pathology. The relevance of host and viral small non-coding RNAs (ncRNAs) in
SARS-CoV pathology has been addressed by deep sequencing RNAs from the lungs
of infected mice, which reproduce the pulmonary pathology observed in humans. The
impact of host ncRNAs in SARS-CoV pathogenesis was studied by analyzing the
miRNAs differentially expressed in mice infected with the virulent SARS-CoV-wt or the
attenuated mutant SARS-CoV-ΔE, only differing in the presence of the E protein
virulence factor. Potential targets of these differentially expressed miRNAs were
involved in biological pathways enriched for inflammatory processes and, in particular,
inflammation mediated by cytokines, suggesting that cellular miRNAs altered by SARSCoV
infection in the presence of E protein contributed to the regulation of the lung
inflammatory pathology. Bioinformatics analysis of RNA sequences revealed for the
first time in coronaviruses small RNAs generated from the SARS-CoV genome
(svRNAs) in infected mouse lungs. Three abundant 18-22 nt svRNAs derived from the
nsp3 (svRNA-nsp3.1 and nsp3.2) and N (svRNA-N) genomic regions of SARS-CoV,
which represented 18% out of the total small viral sequences, were selected for further
study. The generation of these svRNAs was confirmed by RT-qPCR in different cell
types infected either by wt or E gene-mutant SARS-CoVs. Production of SARS-CoV
svRNAs was cell type and host species independent, but it was dependent on the
extent of viral replication. Biogenesis of svRNAs was independent of host RNase III
nucleases responsible for miRNA canonical processing, suggesting the requirement of
alternative mechanisms involving viral proteins or cellular factors induced during
infection. The production of svRNAs in cell culture infection had a positive, although
modest effect on SARS-CoV growth. svRNAs specifically repressed the expression of
mRNA targets with complementary 3’ UTR sequences, suggesting a posttranscriptional
silencing effect similar to cellular miRNAs. svRNA-N also silenced
mRNA target expression during infection. In vivo inhibition of svRNA-N with antisense
oligonucleotides (antagomirs) intranasally inoculated in mice prior to SARS-CoV
infection significantly reduced inflammatory cell infiltration and edema induced by
SARS-CoV without affecting viral titers. Accordingly, a significant decrease in the
expression of pro-inflammatory cytokines CCL2, IL-6 and CXCL10, associated with
SARS-CoV pathology, was also observed. Together, these results indicate that
svRNAs generated from the SARS-CoV genome contribute to lung inflammatory pathology and highlight the potential of svRNA-N antagomirs in antiviral therapy. El virus causante del síndrome respiratorio agudo y grave (SARS-CoV) produce una
enfermedad mortal caracterizada por una respuesta inflamatoria exacerbada y elevada
patología pulmonar. En esta tesis se ha investigado la relevancia de los RNAs no
codificantes (ncRNAs) del hospedador y del virus en la patología del SARS-CoV mediante
secuenciación masiva de los RNAs de pulmones de ratones infectados, que reproducen la
patología pulmonar observada en humanos. El impacto de los ncRNAs del hospedador en
la patogénesis del SARS-CoV se ha estudiado analizando los miRNAs diferencialmente
expresados en pulmones de ratones infectados con el virus virulento SARS-CoV-wt o el
atenuado SARS-CoV-ΔE, que solo difieren en la presencia de la proteína E, un factor de
virulencia. Las dianas potenciales de los miRNAs diferencialmente expresados estaban
implicadas en rutas celulares significativamente enriquecidas en procesos inflamatorios, y
en particular, en inflamación mediada por citoquinas, sugiriendo que los miRNAs alterados
en la infección en presencia de la proteína E participan en la regulación de la patología
pulmonar inflamatoria. El análisis bioinformático de las secuencias RNA reveló por primera
vez en coronavirus la existencia de ncRNAs pequeños derivados del genoma de SARSCoV
(svRNAs) en los pulmones de ratones infectados. Se seleccionaron tres svRNAs entre
los más abundantes, que representaban un 18% del total de las secuencias pequeñas
derivadas del virus. Los svRNAs tenían un tamaño de 18-22 nt y derivaban de los genes
nsp3 (svRNA-nsp3.1 and nsp3.2) y N (svRNA-N). Los tres svRNAs se detectaron por RTqPCR
en distintos tipos celulares infectados con el SARS-CoV-wt o con mutantes del gen
E y su producción dependía de los niveles de replicación viral. La biogénesis de los
svRNAs era independiente de las RNasas III celulares responsables del procesamiento
canónico de miRNAs, sugiriendo el requerimiento de proteínas virales o celulares inducidas
durante la infección para su producción. Los svRNAs tenían un efecto positivo, aunque
modesto, en el crecimiento viral en cultivos celulares. Los tres svRNAs reprimieron
específicamente la expresión de mRNAs con secuencias diana complementarias en el 3’
UTR, sugiriendo un efecto de silenciamiento postranscripcional similar al de los miRNAs
celulares. Además, el svRNA-N también silenció la expresión de mRNAs diana durante la
infección. La inhibición del svRNA-N in vivo con oligonucleótidos antisentido (antagomirs)
administrados intranasalmente antes de la infección redujo significativamente el edema y
los infiltrados de células inflamatorias inducidos por SARS-CoV, destacando que no se
afectó el título viral. Además, se observó una reducción significativa de las citoquinas proinflamatorias
CCL2, IL-6 y CXCL10 asociadas con la patología del SARS-CoV. En
conjunto, estos resultados indicaron que los svRNAs derivados del genoma de SARS-CoV
contribuyen a la patología inflamatoria pulmonar e identifican a los oligonucleótidos
antisentido frente a svRNA-N como potencial terapia antiviral.
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Texto de la Tesis Doctoral
Google Scholar:Morales Rodríguez, María Lucía
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