Identification of new urine biomarkers for the detection of prostate cancer
- Autores: Marina Rigau Resina
- Directores de la Tesis: Jaume Reventós Puigjaner (dir. tes.), Jaume Farrés i Vicén (dir. tes.), Juan Morote Robles (dir. tes.), Andreas Doll (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2011
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Joan Xavier Comella i Carnicé (presid.), Francesc Canals Suris (secret.), Pedro R. Cutillas (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
El càncer de pròstata (CP), és la segona causa de mort per malaltia oncològica en els homes del món occidental. S’estima que un de cada sis homes desenvoluparà un càncer d’aquest tipus al llarg de la seva vida. El CP afecta com el seu nom indica, a la pròstata. La pròstata, és un òrgan glandular de l’aparell genital-urinari masculí. Té la mida d’una nou i es localitza sota de la bufeta, envoltant la uretra i davant del recte. La seva funció és secretar productes que s’afegiran al líquid seminal amb la finalitat de nodrir i protegir els espermatozous. El actual diagnòstic del CP es basa en una triada diagnòstica que consta de; l’anàlisi dels nivells de PSA (Prostate Specific Antigen) en sèrum, el tacte rectal (TR) i finalment la biòpsia prostàtica. Quan els nivells de PSA en sèrum es situen per sobre de 4 ng/mL i/o el TR és sospitós, l’uròleg pot estimar quina és la probabilitat que el pacient estigui afectat per un CP i per tant decidir la necessitat de practicar o no una biòpsia prostàtica, que permetrà establir el diagnòstic definitiu. La introducció del test del PSA, a finals dels anys 80, s'ha traduït en una millora del diagnòstic precoç del CP, moment en el qual les opcions de tractament per el són eficaces. No obstant això, malgrat aquesta detecció primerenca, la mortalitat per CP no ha disminuït significativament en els últims anys. El principal problema del PSA com a marcador d’screening és que aquest presenta un nivell d’especificitat baix (30% aprox) i alhora, un valor predictiu negatiu baix. Això es tradueix en que al voltant d'un terç de tots els homes sotmesos a una biòpsia seran positius per CP. Com a resultat dels seus persistents nivells sèrics de PSA, però els resultats negatius de la biòpsia, aquests homes es sotmeten a repetides biòpsies. Tot i el importants avenços en la investigació de biomarcadors de CP, alguns homes encara estan sobre-diagnosticats de CP “indolent”, mentre que d’altres moren de malaltia agressiva que s'ha diagnosticat massa tard. Aquesta situació es coneix com "dilema diagnòstic". És per tot això, que el càncer de pròstata, es beneficiaria de l’existència de nous marcadors d’screening més específics i alhora d’un diagnòstic menys invasiu. Per altra banda, una millora en el diagnòstic evitaria un gran nombre de biòpsies innecessàries i conseqüentment un important estalvi econòmic en el cost sanitari actual. La recerca de nous marcadors en el càncer de pròstata suposa un camp de treball important en la detecció precoç d’aquest tipus de càncer. Donada la situació de la pròstata a l’organisme, sota la bufeta i envoltant la uretra, les secrecions i inclús les mateixes cèl·lules prostàtiques, ja siguin normals o malignes, poden trobar-se presents en l’orina. És per això que considerem l’orina com una font important d’informació, a través de la qual es podria arribar a determinar quina situació s’està donant a l’òrgan en qüestió. Altres estudis evidencien l’existència de potencials biomarcadors en l’orina que podrien ajudar en la millora del diagnòstic del CP. A nosaltres ens ocupa l’estudi d’aquelles molècules de RNA així com de les molècules protèiques que es troben a l’orina. Suposem doncs, que un massatge prostàtic enriqueix la mostra d’orina de tot tipus de molècules proteiques. Així doncs, la nostra hipòtesi de treball recolza que, l’orina després d’un massatge prostàtic pot ser el fluid ideal per a la recerca de nous biomarcadors capaços de discriminar entre pacients amb o sense càncer de pròstata. L’objectiu principal de l’estudi és diagnosticar el CP assimptomàtic per us sistema minimament invasiu, que consisteix en l’anàlisi de l'ARN o de la proteïna en l'orina obtinguda després d’un massatge prostàtic i, superar la baixa especificitat de l’actual sistema d’screening (PSA en sèrum) mitjançant l'ús de biomarcadors addicionals (RNA o proteina) per tal de reduir el nombre de biòpsies innecessàries (reduir els costos socio-econòmics, així com la reducció dels efectes secundaris no desitjats). 1. ANÀLISI TRANSCRIPTÒMICA: 1a) “PSGR and PCA3 as Biomarkers for the Detection of Prostate Cancer in Urine” Rigau M et al., Prostate. 2010 Dec 1;70(16):1760-7. En el primer estudi, mitjançant l’anàlisi de transcripts per RTqPCR en 215 (34% amb CP) mostres de sediements d’orines de pacients (obtingudes després d’un massatge prostàtic), es va determinar la utilitat de PSGR (Prostate Specific G-coupled receptor), previament descrit com a sobre-expressat en mostres de teixit de CP, com un nou biomarcador, comparable a PCA3 (ja conegut), per a la detecció del CP en orines (taula 1). Per l'anàlisi de la corba ROC vàrem determinar els valors de l’Area sota la corba (AUC) de PSGR (AUC 0,68) i PCA3 (AUC 0,66). Fixant la sensibilitat a 95%, aconseguim un valor d’especificitat de 15% per PSGR i el 17% de PCA3. Alhora vàrem veure que al combinar els dos biomarcadors (PSGRvPCA3) mitjançant un anàlisi “multiROC”, els resultats van millorar significativament en termes de rendiment del biomarcador (AUC 0,73) com de la seva especificitat (34%). En conclusió, podem dir que PSGR presenta un comportament similar al biomarcador estàndard per CP en orina (PCA3), però, és necessàri la realització d’estudis futurs per millorar encara més el rendiment d'aquesta prova. 1b) “A Three-Gene panel on urine increases PSA specificity in the detection of prostate cancer” Rigau et al., Prostate. 2011 Apr 25. doi: 10.1002/pros.21390. En un segon estudi, vàrem estudiar la possibilitat de multiplexar diferents biomarcadors, per tal de ser capaços de guanyat especifcitat sense perdre sensibilitat en la detecció del CP. Donada l’heterogeneïtat del CP la idea d’utilitzar diferents marcadors per a la seva detecció es presenta atractiva. Mitjançant l’anàlisi de transcripts, per RTqPCR, en 215 (37% amb CP) mostres de sediements d’orines de pacients (obtingudes després d’un massatge prostàtic), vàrem determinar la utilitat de PSMA (Prostate Specific Membrane Antigen), un marcador descrit anteriorment com a sobre-expressat en el CP, com a biomarcadors per a la detecció de CP en orina. L’anàlisi de corbes ROC revela un rendiment similar PSMA (AUC 0,62), PSGR (AUC 0,65) i PCA3 (AUC 0,60) (Taula 1). Per tal de millorar l'eficàcia diagnòstica d'aquests biomarcadors es van combinar PSMAvPSGRvPCA3 (3M), utilitzant un anàlisi de multiROC. L’AUC del 3M (AUCm) (0,74) millora notablement, en comparació amb els valors individuals per a cada un dels marcadors. D'altra banda, si combinem 3M amb el valor de PSA en sang l’AUCm (0,77) va ser encara millor (taula 11). Si fixem la sensibilitat a 96%, l'especificitat del model 3M manté una especificitat del 34%, mentre que no es va observar augment en d’aquest valor quan ho combinem amb PSA en sang (34%) (Taula 11). El comportament d'aquests tres marcadors en una subpoblació de l’estudi que presentava nivells de PSA en sang entre 4-10 ng/mL i sense informació d’una biòpsia prèvia "zona gris del PSA" és de PSMA (AUC 0,74), PSGR (AUC 0,66) i PCA3 (AUC 0,61). Per al model combinat (3M), l’AUCm és de 0,82 (Taula 11). Fixant la sensibilitat al 96%, l'especificitat del model combinat (3M) manté una especificitat del 50%. En conclusió, aquests resultats demostren que la combiació de diferents marcadors proporciona una major especificitat a la prova sense comprometre el valor de sensibilitat. Expresat en el nombre de biopsies que s’haurien pogut estalviar, els valors se situen al voltant del 34% de biòpsies estalviades. 1c) “Behavior of PCA3 gene in the urine of men with high grade prostatic intraepithelial neoplasia” Morote and Rigau et al., World J Urol. 2010 Dec;28(6):677-80. El tercer estudi, està centrat en la utilitat, del ja conegut biomarcador per CP en orina (PCA3), per a l’identificació una lessió pre-maligna a la pròstata, així com la seva utilitat en la selecció dels homes amb biòpsies negatives, que requereixen la repetició del procediment. La troballa de les lesions de HGPIN (High grade preneoplastic intraepithelial lesion) és una indicació freqüent de la repetició de la biòpsia. Tot i la controvèrsia al voltant de la definició de HGPIN com a lessió pre-maligna i la necessitat de repetició de la biòpsia, encara avui en el nostre hospital s’indica el control exhaustiu del pacient, així com la repetició de la biòpsia en un periode de relativament curt de temps. Per a aquest estudi es van seleccionar un subgrup de pacients amb HGPIN (n=64) i com a grups control, es van seleccionar els homes amb CP (n=83) i homes amb patologia benigne de la pròstata (BP) (n=97). Després de l’anàlisi dels transcripts de PCA3 per RTqPCR en mostres de sediements d’orines de pacients (obtingudes després d’un massatge prostàtic), i de l'anàlisi de la corba ROC, es van obtenir els següents resultats; HGPIN vs CP (AUC 0,63) i BP vs PC (AUC 0,71). Aquests resultats demostren la capacitat dels transcripts de PCA3, en orina obtinguda deprés d’un massatge prostàtic, per a l’identificació d’homes amb CP així com la identificació de pacients amb HGPIN. 2. ANÀLISI PROTEÒMICA COMPARATIVA L’objectiu principal d’aquesta segona part és determinar un perfil proteòmic a l’orina capaç de diferenciar entre pacients amb CP i controls sans. Per dur a terme aquest objectiu ens vàrem plantejar fer una part inicial de discovery, que vàrem complementar amb “data mining” i finalment vàrem verificar mitjançant una tècnica proteòmica independent. 2a) Per la part de discovery es va dur a terme l’anàlisi comparativa de “Differential in Gel Electrophoresis (DIGE). Es van fer dos experiments independents, amb mostres de sobrenedants d’orines (on trobem la fracció soluble de les proteïnes). En el primer experiment es van comparar 6 mostres de proteïna total de pacients amb CP i 6 mostres controls. En el segon experiment es van comparar 9 mostres, de proteïna pre-tractada amb una tècnica de depleció per les proteïnes majoritàries, de pacients amb CP i 9 mostres de pacients control. Un total de 24 proteïnes (9 sobre- i 15 infra-expresades) vàren ser identificades per MALDI-TOF. Una anàlisi informàtic de les proteïnes va mostrar que la majoria d'aquestes proteïnes identificades es secreten els components de diverses xarxes ben conegudes, el càncer funcionals i la inflamació, com ara NF?B, PDGFB? i ?-catenina. D'altra banda, a causa del fet que hem utilitzat sobrenadants d'orina, on podem trobar proteïnes solubles secretades, la majoria de les proteïnes identificades (62%) es van localitzar en l'espai extracelular. Mitjançant una tècnica de proteòmica dirigida (Selected Reaction Monitoring: SRM) es van quantificar de forma relativa, sense l’adició d’estandards interns marcats, un total de 15 (dels 24 biomarcadors) en una població independent de 50 mostres (38% amb CP). Després d'una anàlisi de regressió logística de les dades obtingudes a través de l'assaig de SRM, es va obtenir un panell de set pèptids que corresponen a 5 proteïnes, capaços de distingir entre les mostres de CP i mostres controls amb una sensibilitat del 95% i una especificitat del 78 %. 2b) La segona part de l’estudi de proteómicas es basa en la verificació de les proteïnes prèviament qualificades i alhora l’estandarització dels mètodes de preparació de mostres per al seu posterior anàlisis mitjançant la tècnica de SRM. Les 5 proteïnes que formen part del panell identificat, juntament amb altres proteïnes biologicament rellevants, definides a la nostre fase de discovery, i juntament amb altres proteïnes descrites a la literatura, vàren ser escollides per una segona fase de qualificació i verificació en una població independent de 107 pacients, mitjançant un assaig de SRM en el qual es pretén quantificar de forma absoluta (adició de pèptids estàndards marcats), un total de 42 proteïnes. Prèviament a l’evaluació d’aquestes proteïnes, es va dur a terme una estandarització del protocol d’extracció de proteïna en mostres d’orina, amb l’objectiu de maximitzar la senyal obtinguda en els experiments de SRM. La precipitació amb Acetonitril (a temperatura ambient) seguida de la digestió de les proteïnes en solució amb condicions de ratio 1:10 (trypsine:protein), “over-night” i l’adició de “NAcetyl cysteine”, proporcionen els millors valors de quantificació absoluta. L’anàlisi estadístic de les dades generades d’aquesta segona fase de qualificació i verificació de les proteïnes està encara inacabat, de manera que ara per ara no podem conclou-re res. En conclusió, les dos linies experimentals que aquí es presneten (ARN i proteïnes) represeten resultats prometedors. No obstant això, estudis de validació en poblacions independents (del tipus estudi multicèntric) són necessaris per acabar amb un biomarcador o un panell de biomarcadors vàlid per al diagnòstic del CP. Per altra banda, el seguiment dels pacients ja analitzats poden relevalar dades interessant, com la utilitat pronòstica d’aquests biomarcadors. Els resultats obtinguts haurien de tenir una aplicació clínica ràpida que, juntament amb els paràmetres d’screening actual (nivells sèrics de PSA i DRE), podrien ajudar en la pressa de decisions per CP.
