Estudio del silenciamiento de los genes farnesildifosfato sintasa e Ingeniería metabólica para la producción de sesquiterpenos en Arabidopsis

• Autores: Paola Andrea Andrade Poveda
• Directores de la Tesis: David Manzano Alias (dir. tes.), Montserrat Arró Plans (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2014
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Albert Boronat (presid.), Silvia Fornalé Fornalé (secret.), Teresa Capell Capell (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • La enzima FPS ocupa una posición clave en la vía del MVA, ya que a partir de sus sustratos, IPP y DAMPP, y del producto de la reacción que cataliza, FPP, se sintetizan compuestos isoprenoides imprescindibles para el crecimiento y desarrollo de las plantas, y para su relación con el entorno. A. thaliana posee dos genes FPS, AtFPS1 y AtFPS2, que codifican tres isoenzimas, FPS1L, FPS1S y FPS2. La caracterización de mutantes de A. thaliana con pérdida de función de los genes AtFPS1 y AtFPS2 demostró que la actividad FPS es esencial para el desarrollo de las plantas, ya que el doble mutante Atfps1:Atfps2 presenta letalidad embrionaria. La letalidad embrionaria del doble mutante hizo imposible estudiar en profundidad la función y los mecanismos de regulación en los que se encuentran implicadas las isoenzimas FPS en las plantas adultas. En el Capítulo de esta tesis doctoral se atenuó la expresión de los genes AtFPS empleando una estrategia de silenciamiento inducible basada en el uso de microRNAs artificiales (amiRNA). Se obtuvieron líneas mutantes de fps condicionales en donde se observó una importante reducción en los niveles de mRNA, proteína y actividad FPS, un fenotipo de clorosis y una reducción importante del tamaño especialmente en la raíz, una reducción significativa en los niveles de los esteroles mayoritarios, un aumento de la actividad HMGR, una disminución en el número, el tamaño de los cloroplastos, en conjunto con una dramática alteración en la organización de los cloroplastos y una reducción en los niveles de clorofilas y carotenoides. Además el estudio de la expresión génica global mediante RNA¿seq identificó importantes grupos de genes desregulados asociados a la homeostasis de Fe, al metabolismos antioxidante GST y a la vía de señalización del JA. Todos estos antecedentes sugieren que el bloqueo en la síntesis de FPP, además de la reducción de los niveles de isoprenoides citosólico, desencadena a través de mecanismos aún desconocidos, una respuesta que interconectan la vía de isoprenoides, ubicada en el citosol, con el cloroplasto. Este trabajo representa la primera aproximación transcriptómica sobre la función de los genes AtFPS, la cual entrega datos relevantes acerca de su efecto sobre la expresión génica global y por lo tanto, sobre su interacción en otros procesos esenciales para la planta hasta completamente desconocidos. Objetivos 40 Por otro lado, en el Capítulo II se abordó una serie de estrategias para la producción en el citosol de nerolidol, componente de la HIVPs considerado uno de los volátiles de interés ecológico y económico, por su capacidad para atraer insectos carnívoros. Trabajos previos apuntaban a que la limitante para incrementar la producción de este compuesto en el citosol atendía a la disponibilidad del sustrato FPP. Esto puede explicar el bajo rendimiento obtenido en diversos intentos realizados para producir sesquiterpenos en el citosol mediante la expresión de diferentes sesquiterpeno sintasas. En cambio, la expresión de sesquiterpenos sintasas en otros compartimientos celulares, como el cloroplasto y la mitocondria, ha permitido superar los mecanismos homeostáticos que limitan la disponibilidad del FPP citosólico, a pesar de que las sesquiterpeno sintasas son enzimas que habitualmente se encuentran en el citosol. En este contexto, mediante la expresión transitoria en hojas de N. benthamiana de las diferentes versiones de la sesquiterpeno sintasa FaNES1 anclada a las membranas del RE, se observó un incremento de la producción de nerolidol en el compartimento citosólico. Además se utilizaron enzimas bifuncionales FPS1/FaNES1 que permitieron la producción de nerolidol en el citosol Todos estos resultados sugieren que la síntesis de nerolidol depende esencialmente de los niveles de proteína FaNES1, lo que indica que la limitación para la producción de sesquiterpenos en este compartimento es un problema de estabilidad de la proteína y no de disponibilidad de sustrato.