Resumen de Influència de components de vins sobre el metabolisme d'Oenococcus oeni i sobre la seva dinàmica de poblacions a la fermentació malolàctica.
Ramon Carreté Aixalà
- English
INFLUENCE OF WINE COMPONENTS OVER THE METABOLISM OF Oenococcus oeni AND OVER THE POPULATION DYNAMICS DURING MALOLACTIC FERMENTATION Malolactic fermentation (MLF) in wine is carried out by certain lactic bacteria which decarboxylate L-malic acid to L-lactic and CO2. Oenococcus oeni is the most tolerant species under the unfavourable wine conditions (nutrients starvation, low pH, ethanol, fatty acids from yeasts, SO2, etc.) and the main responsible of driving the MLF. As a consequence of the MLF, the wine quality improves because the acidity decreases, the organoleptic characteristics are better and the microbiological stability of wine increases.
Some biochemical parameters, indicators of metabolic cellular conditions, are the ATPase activity and the expression of stress proteins and exoproteases involved in the obtention of nitrogen. On the other hand, some unfavourable conditions for bacterial growth can modify the bacterial population dynamics during MLF by effects over species and strains of the same species.
The studies performed in this work show that ATPase-membrane activity principally corresponds to an H+-ATPase, which is affected by cellular viability inhibitory concentrations of ethanol, SO2, copper and fatty acids. So, a direct relationship between growth inhibition of O. oeni in real cellar conditions and ATPase activity inhibition is stablished.
The stress protein profile produced by ethanol is not significantly different from the controls one, whereas the incubation in acidic conditions or in the presence of C12 fatty acid inhibits the protein expression in general. Copper and low pH induce the overexpression of a proteinic band close to 40 kDa, as SO2 does, which N-terminal sequence shows a significant identity with the family of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases (GAPDH). In his turn, SO2 inhibits the cytoplasmatic GAPDH activity also.
Using RT-PCR, it has been shown that gene expression levels of hsp18 (the gene of a heat-shock protein found in O. oeni) as a response to the heat shock are near fifty-fold greater than in normal conditions. On the other hand, in contact with inhibitory concentrations of C12, copper or SO2, it only appears weak induction as a response to copper.
About the exoprotease activity, this one is not significative in the strains studied, except for final exponential growth phase in the presence of high ethanol levels (14 %). Under conditions of nitrogen starvation, its observed a direct relationship between the bioavailability of a-amino nitrogen and growth rate of O. oeni.
Different microvinification conditions were assayed using three different strains (CECT 4100 as the type strain; CR1, an strain isolated by our research group, and Vitilactic, a commercial strain). The type strain showed fewer ability for adaptation, whereas the isolated strain was the responsible for performing the FML the most times. To demonstrate that, we used Molecular Biology techniques, like specific PCR and RAPD-PCR.
In cellar vinifications with normal and high levels of SO2 and lysozyme, it was observed a dominance of O. oeni species from the beginning of the alcoholic fermentation, and a different evolution of the populations in the presence of lysozyme. In all the cases, its the same strain which performs FML and it coincides with that one imposed in other campaigns and isolated by our group as CR1.
- català
INFLUÈNCIA DE COMPONENTS DELS VINS SOBRE EL METABOLISME DOenococcus oeni I SOBRE LA SEVA DINÀMICA DE POBLACIONS A LA FERMENTACIÓ MALOLÀCTICA La fermentació malolàctica (FML) del vi és el resultat del metabolisme dalgunes espècies de bacteris làctics que converteix làcid L-(-)-màlic en L-(+)-làctic i CO2. Lespècie Oenococcus oeni és la més tolerant a les condicions poc favorables del vi (deficiències nutritives, pH baix, etanol, àcids grassos dels llevats, SO2, etc.) i la que habitualment realitza la FML. A part de la disminució dacidesa, la FML contribueix a lestabilització microbiològica del vi i a millorar-ne les qualitats organolèptiques.
Alguns paràmetres bioquímics indicadors de lestat metabòlic cel·lular són lactivitat ATPasa, lexpressió de proteïnes destrès i dexoproteases involucrades en lobtenció de fonts de nitrogen. Daltra banda, algunes de les condicions desfavorables per al creixement bacterià poden influir sobre la dinàmica de poblacions de bacteris làctics durant la FML, tant a nivell despècie com de soca.
Els estudis realitzats en aquesta tesi indiquen que lactivitat ATPasa de membrana, deguda principalment a una H+-ATPasa, es veu afectada per concentracions inhibidores de la viabilitat cel·lular detanol, SO2, coure i àcids grassos, per la qual cosa es pot establir una relació directa entre la inhibició del creixement dO. oeni en condicions reals de vinificació i la inhibició de lactivitat ATPasa. Al seu torn, letanol no produeix un perfil de proteïnes de membrana excessivament diferent respecte al control, mentre que la incubació en condicions àcides o en presència de làcid gras C12 inhibeix, en general, lexpressió proteica.
El coure i lacidesa afavoreixen la sobreexpressió duna proteïna de membrana, de 40 kDa, així com el SO2, la seqüència N-terminal de la qual correspon a la família de gliceraldehid-3-fosfatdeshidrogenases (GAPDH). El SO2 també inhibeix lactivitat GAPDH citoplasmàtica, i per tant, el mecanisme glucolític dobtenció denergia per part dO. oeni.
Mitjançant RT-PCR, sha comprovat que els nivells dexpressió gènica dhsp18 (gen duna proteïna destrès descrita en O. oeni) en resposta al xoc tèrmic són fins a cinquanta vegades superiors que en les condicions controls, mentre que en presència de concentracions de C12, coure o SO2 inhibidores del creixement, únicament sobserva una certa inducció en resposta al coure i en condicions de fase exponencial de creixement.
Pel que fa a lactivitat exoproteasa, aquesta no és significativa en les condicions experimentals emprades i en les soques estudiades, excepte al final de la fase exponencial de creixement i en presència de dosis elevades detanol (14 %). En condicions de carència nutricional nitrogenada, sha observat una relació directa entre la biodisponibilitat de nitrogen a-aminat i la taxa de creixement dO. oeni.
Sassajaren diferents condicions de microvinificació, amb tres soques diferents (CECT 4100, soca tipus; CR1, soca aïllada pel nostre grup de recerca, i Vitilactic, soca comercial). La soca tipus va mostrar menor capacitat dadaptació, mentre que la soca aïllada simplantà en la majoria de casos. Per a comprovar-ho, sempraren tècniques de Biologia Molecular, com ara la PCR i la RAPD-PCR.
En vinificacions amb concentracions moderades i elevades de SO2 i lisozim, sobservà un predomini de lespècie O. oeni ja des de linici de la fermentació alcohòlica, i una evolució diferent de les poblacions en presència de lisozim. En tots els casos, una mateixa soca simposà durant la FML, i coincideix amb la que shavia implantat en campanyes anteriors i aïllada pel nostre grup com a CR1.
