Resumen de Influencia de los factores del donante en el aislamiento y cultivo de hepatocitos humanos
Mª Amparo Martínez Blasco
El trasplante celular hepático (TCH) ha sido y sigue siendo objeto de estudio como terapia en el caso de enfermedades hepáticas terminales. Puede ser una alternativa al trasplante de un hígado entero en casos seleccionados como son el fallo hepático agudo y determinadas enfermedades metabólicas. [Mitry et al 2002, Rust et al. 2000] En la actualidad el único tratamiento eficaz para las enfermedades hepáticas en estadio terminal es el trasplante hepático [Strom et al. 2003, Mir et al. 2001] El trasplante de hígado es un hecho consolidado en el mundo entero. Los resultados son excelentes con una supervivencia a 1 y 5 años del 82% y 66.8 % respectivamente [Rust et al.2000]. Sin embargo, debido a la escasez de donantes de órganos, la lista de espera para trasplante hepático continúa creciendo y sigue existiendo un número de pacientes que fallece en dicha lista sin haber llegado a trasplantarse. Estos enfermos podrían beneficiarse del transplante de hepatocitos aislados, que podría suplir el déficit de función hepática durante el tiempo suficiente para mantener la vida del paciente hasta que el hígado se recupere o hasta que llegue un injerto de un donante compatible. [Mitry et al. 2002, Rust et al. 2000] La aplicabilidad clínica del transplante celular hepático se ha demostrado mediante la realización de estudios en modelos animales y en algunos casos puntuales de aplicación en humanos. El trasplante de hepatocitos aislados en animales ha sido llevado a cabo por varios grupos desde hace una década y en diferentes enfermedades, como por ejemplo: Hipoalbuminemia en ratas Nagase.[Lilja et al. 1997, Oren et al. 1999], enfermedad de Wilson en ratas Long-Evans y en ratones, [Yoshida et al. 1996, Allen et al. 2004]. El síndrome de Crigler-Najjar en ratas Gun. [Matas et al. 1976], hipercolesterolemia en conejos Watanabe afectos de hiperlipidemia hereditaria. [Wierdeker et al.1990]. Modelos de fallo hepático agudo en ratas Lewis, inducido con fenobarbital y tetracloruro de carbono (CCL4). [Kobayashi et al. 2000] y ratas F344 en las que el fallo hepático se indujo con D-galactosamina [Gupta et al. 2000]. Del mismo modo se ha realizado el transplante de hepatocitos en humanos: en 7 pacientes con fallo hepático agudo, 4 de ellos con grado IVb de encefalopatía, de los cuales 3 fallecieron en las primeras 48 horas; y 3 con grados III y IVa de encefalopatía, los cuales presentaron una evidente recuperación medida con el grado de encefalopatía y datos analíticos (BR, GOT, GPT, TP y amonio en sangre). [ Habibullah et al. 1994]. Fox et al. en 1998 comunicaron un caso de una niña de 10 años afecta del Síndrome de Crigler- Najjar tipo I. El grupo de Strom trasplantó hepatocitos aislados a 7 pacientes (5 por fallo hepático agudo, 1 por déficit de alfa-1-antitripsina y 1 por déficit de ornitina transcarbamilasa). Con diferentes resultados. Bilir et al trasplantaros hepatocitos a 5 pacientes con fallo hepático agudo (3 tóxico y 2 viral) en los que consiguieron supervivencias de hasta 52 días. Una de las principales limitaciones actuales para la generalización del uso del trasplante de hepatocitos humanos adultos es la falta de fuentes adecuadas de hepatocitos humanos viables. [Serralta et al. 2003] En espera del desarrollo de tecnologías que consigan nuevas fuentes de hepatocitos humanos óptimos para transplante celular, actualmente éstos proceden fundamentalmente de reducciones hepáticas o injertos no válidos para transplante. [Mitry et al. 2003] Es posible que se pueda implementar el proceso de aislamiento de hepatocitos gracias a la modificación de factores dependientes del proceso de obtención de tejido hepático, pero siguen existiendo ciertos factores limitantes: Se desconocen los factores del donante que resultan en una mayor rentabilidad del procedimiento de aislamiento de hepatocitos. Su identificación permitiría acciones específicas encaminadas a mejorar el aislamiento [Mitry et al, 2003]. La esteatosis es el principal motivo de exclusión de los injertos para implante, y supone un descenso drástico en la capacidad del método de digestión enzimática para la obtención de hepatocitos humanos viables. No existen estudios predictivos de la eficacia del proceso de aislamiento y cultivo de hepatocitos humanos a partir de tejido hepático adulto, es decir, no se conocen cuáles son las características ideales de los donantes de hepatocitos para hacer una selección de los mismos [Mitry et al, 2004]. PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO: El trasplante de hepatocitos puede ser una alternativa válida al trasplante de hígado entero en determinados casos. Con ello se conseguiría disminuir la mortalidad en la lista de espera de trasplante hepático. La identificación de factores dependientes del donante que influyan en el aislamiento y cultivo de los hepatocitos humanos adultos permitiría una mejor selección de los pacientes donantes. HIPÓTESIS: Existen características relacionadas con el donante y factores relacionados con el proceso de obtención de los hepatocitos, que influyen en el aislamiento y cultivo de los mismos. OBJETIVOS: El fin último del estudio es la obtención de hepatocitos humanos aislados viables para realizar el trasplante celular en determinadas enfermedades como alternativa al trasplante de órgano sólido. Por tanto los objetivos del estudio son: I. Realizar un análisis descriptivo y comparativo de todas las variables en una serie de pacientes intervenidos en la Unidad de Cirugía Hepatobiliopancreática y Trasplante Hepático del Hospital Universitario La Fe de Valencia y en la Unidad de Cirugía General y Aparato Digestivo del Hospital General Universitario de Valencia desde diciembre de 1995 hasta marzo de 2005. Así mismo se realizó el análisis de todas las variables de una serie de donantes cadáver, de hígados que posteriormente fueron implantados, en la Unidad de Cirugía Hepatobiliopancreática y Trasplante Hepático del Hospital Universitario La Fe de Valencia, desde febrero de 2002 hasta marzo de 2005. Las variables a analizar fueron: a) Características clínicas y antecedentes personales. b) Características de laboratorio. c) Variables relacionadas con la intervención en los donantes vivos. d) Variables relacionadas con el proceso de extracción hepática en los donantes cadáver. e) Variables relacionadas con la toma de la biopsia. f) Variables relacionadas con el aislamiento de hepatocitos. II. DONANTES VIVOS: Identificación de las variables predictoras o independientes de los donantes que influyen en los resultados del aislamiento de los hepatocitos: a) Viabilidad. b) Rendimiento. c) ECOD d) 6BOHT. III. DONANTES CADÁVER: Identificación de las variables predictoras o independientes de los donantes que influyen en los resultados del aislamiento de los hepatocitos: a) Viabilidad. b) Rendimiento. MATERIAL Y MÉTODOS: Se trata de un estudio transversal, observacional y retrospectivo en el que se revisaron 172 historias clínicas correspondientes a 172 pacientes. Se analizaron dos grupos: biopsias procedentes de donantes vivos (pacientes intervenidos por diferentes patologías en cirugía programada) y biopsias procedentes de donantes cadáver. CRITERIOS DE INCLUSIÓN DEL ESTUDIO: Donantes vivos: Se incluyeron todos los pacientes intervenidos en el Servicio de Cirugía General del Hospital General de Valencia y en la Unidad de Cirugía Hepatobiliopancreática y Trasplante del Hospital Universitario La Fe de Valencia por diferentes patologías en cirugía programada desde diciembre de 1995 hasta marzo de 2005 que firmaron el consentimiento informado. Donantes cadáver: La obtención de biopsias para su procesamiento se realizó en todos los casos por el mismo cirujano extractor, por tanto se incluyeron todos los donantes cadáver en cuya extracción hepática participó este mismo cirujano (E.P.I) desde febrero de 2002 hasta marzo de 2005 y en los que el tiempo de isquemia fría menor a 960 minutos (16 horas). CRITERIOS DE EXCLUSIÓN DEL ESTUDIO: Donantes vivos: - Hígado cirrótico. - No haber firmado el consentimiento informado. - Mala digestión enzimática de la biopsia en el procesamiento. Donantes cadáver: Hígado cirrótico. Mala digestión enzimática de la biopsia en el procesamiento Tiempo de isquemia fría superior a 960 minutos (16 horas). AISLAMIENTO DE LOS HEPATOCITOS: El aislamiento de los hepatocitos se realizó mediante perfusión con colagenasa (Gómez-Lechón et al, 1997) y se utilizó el medio base de cultivo Ham F12-Williams(1:1) con 1 gr/l de BSA (0.1%) para hepatocitos. Tras realizar la perfusión de los hepatocitos en dos etapas, se centrifuga y se suspenden las células. Las variables a estudio fueron: epidemiológicas, analíticas y anatomopatológicas de los donantes; del proceso de extracción (tiempo de isquemia fría, tipo de líquido de preservación); así como la presencia de esteatosis. Las variables de valoración de la eficacia del procedimiento de aislamiento y cultivo de los hepatocitos fueron: 1) La viabilidad celular (porcentaje de células vivas, medida mediante tinción con azul tripan). 2) El rendimiento del aislamiento (número de células obtenidas por gramo de tejidox106). 3) La capacidad oxidativa de los hepatocitos: midiendo la 7-etoxicumarin O-deetilación (ECOD) como representativa de la actividad CYP total, y la testosterona 6-B hidroxilación (6B-OHT) como indicativa de la actividad CYP3A4, la enzima más abundante en el hígado humano, medidas en pmol/mg/min. ANÁLISIS ESTADÍSTICO: El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 15.0. En todos los casos un p-valor menor que 0.05 fue considerado estadísticamente significativo. En la estadística descriptiva, la prueba no paramétrica de Kolmogórov-Smirnov se empleó para verificar que los datos seguían una distribución Normal. Se efectuó un análisis descriptivo de las características de los donantes por separado: vivos o cadáveres. En la estadística comparativa: Para el análisis de dos variables cuantitativas se empleó el coeficiente de correlación de Pearson en el caso de las variables de distribución normal y el coeficiente de correlación de Spearman en el caso de las variables de distribución no normal. Para analizar la relación entre variables cuantitativas y variables cualitativas categóricas binarias se empleó la prueba no paramétrica de U-Mann-Whitney (variables no normales) y la prueba paramétrica t de Student (variables normales). En el caso de que la variable cualitativa tuviera tres o más grupos se empleó la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis (variables no normales) y la prueba paramétrica análisis de la varianza (ANOVA) (variables normales). Para comparar variables cualitativas se ha empleado la prueba Chi Cuadrado (¿2). Para el análisis multivariante se realizaron regresiones logísticas en el caso de variables discretas y regresiones lineales en le caso de variables cuantitativas continuas. Del mismo modo que en el análisis univariante, en todos los casos, un p-valor menor que 0.05 fue considerado estadísticamente significativo. RESULTADOS: Se expone en este apartado un resumen de las variables que han sido significativas en el análisis univariante y multivariante (Tablas 106 y 107). - Variables estadísticamente significativas en el análisis univariante de los DV y DC. 1: DONANTE VIVO: - Viabilidad (%): IMC, Glucosa (mg/dL), Neutrófilos (%) - Viabilidad ¿70%: BR Total (mg/dL), BR¿1 mg/dL - Rendimiento (cel/g x106): GOT (UI/L), Índice Quick (%), Resección Hepática (SI/NO), Metástasis Hepáticas (SI/NO), Isquemia caliente (SI/NO), Tipo isquemia caliente, Tiempo isquemia caliente (min), Isquemia caliente ¿30 min. - Actividad ECOD (pmol/min/mg): Tiempo Protrombina (seg) - Actividad testosterona-6-ß hidroxilasa (pmol/min/mg): Sexo (Mujer), Peso (Kg), Talla (cm), BR Total (mg/dL), Creatinina (mg/dL), Hb (g/dL), HTO (%), GGT Rangos (UI/L), Resección hepática (SI/NO), Metástasis hepáticas (SI/NO), Peso muestra (g) 2. DONANTE CADÁVER: - Viabilidad (%): Tiempo UCI (h), Tiempo UCI¿ 72 h, Tiempo isquemia fría (min), Tiempo isquemia fría >700 min, Tiempo isquemia fría Rangos - Viabilidad ¿70%: Tiempo isquemia fría (min), Líquido perfusión (Celsior) - Rendimiento (cel/g x106): Sodio (mEq/L), Neutrófilos (%), Glucosa¿ 120 mg/dL, Tiempo isquemia fría >700 min, Tiempo isquemia fría Rangos (min), Peso muestra - Actividad ECOD (pmol/min/mg): Potasio (mEq/L), FA (UI/L), FA Rangos (UI/L) - Actividad testosterona-6-ß hidroxilasa (pmol/min/mg): Edad (años), Peso (Kg), IMC, Medicación previa (SI/NO) Variables estadísticamente significativas en el análisis multivariante de los DV y DC. 1. DONANTE VIVO: - Viabilidad (%): IMC - Viabilidad ¿70%: BR¿1 mg/dL, QT preoperatoria (SI/NO) - Rendimiento (cel/g x106): Índice de Quick (%), Resección hepática (SI/NO) - Actividad ECOD (pmol/min/mg): HTO (%) , Sexo (Hombre) - Actividad testosterona-6-ß hidroxilasa (pmol/min/mg): HTO (%) 2. DONANTE CADÁVER: - Viabilidad (%): Tiempo isquemia fría (min), Líquido perfusión (Celsior) - Viabilidad ¿70%: Tiempo isquemia fría (min), Líquido perfusión (Celsior) - Rendimiento (cel/g x106): Sodio (mEq/L), Neutrófilos (%), Tiempo isquemia fría (min) CONCLUSIONES: 1. Existen grandes diferencias entre las características de los DV y DC. 2. Los donantes vivos presentan mayor viabilidad y rendimiento tras el asilamiento de hepatocitos que los donantes cadáver. 3. Existen características relacionadas con el DV que influyen en el aislamiento y cultivo de hepatocitos de forma independiente: Sobre la viabilidad celular: el IMC, los valores de bilirrubina <1 mg/dL y la quimioterapia preoperatoria,. Sobre el rendimiento: el Índice de Quick y la resección hepática. Sobre la actividad ECOD: el sexo y los valores de hematocrito. Sobre la actividad Testosterona-6-ß hidroxilasa: los valores de hematocrito. 4. Existen características relacionadas con el DC que influyen en el aislamiento y cultivo de hepatocitos de forma independiente: Sobre la viabilidad celular: el tiempo de isquemia fría y el líquido de perfusión. Sobre el rendimiento: el tiempo de isquemia fría y el líquido de perfusión. En base a nuestros resultados y en respuesta a la hipótesis planteada en el estudio, podemos afirmar que: EXISTEN CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS CON EL DONANTE Y FACTORES RELACIONADOS CON EL PROCESO DE OBTENCIÓN DE LOS HEPATOCITOS, QUE INFLUYEN EN EL AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LOS MISMOS. BIBLIOGRAFÍA: 1. Mitry R. and Dhawan A. Hepatocyte transplantation from bench to the bedside. BIMDG bulletin Autum 2002. 2. Rust C. and Gores G.J. Hepatocyte transplantation in Acute Liver Failure: A New Therapeutic Option for the Next Millenium?. Liver Transplantation 2000;6:41-43. 3. Strom S. and Fisher R. Hepatocyte transplantation: New possibilities for Therapy. Gastroenterology 2003;124:568-571. 4. Serralta A., Donato M.T., Orbis F., et al. Functionality of cultured human hepatocytes from elective samples, cadaveric grafts and hepatectomies. Toxicology in vitro 2003;17:769-774. 5. Lilja H., Arkadopoulos N., Blanc P., et al. Fetal rat hepatocytes: Isolation, characterization and transplantation in the Nagase Analbuminemic rats. Transplantation 1997;64::1240-1248. 6. Oren Ran, Dabeva M. D., Petkov P.M., et alRestoration of serum albumin levels in Nagase Analbuminemic rats by Hepatocyte Transplantation. Hepatology 1999;29:75-81 7. Kobayashi N., Ito M., Nakamura J., Cai J., Gao C., Hammel J.M., and Fox I.J. Hepatocyte transplantation in rats whit decompensated cirrhosis. Hepatology 2000; 31: 851-857. 8. Gupta S., Rajvanshi P., Irani A.N., et al. Integration and proliferation of transplanted cells in hepatic parenchyma following D-galactosamine-induced acute injury in F344 rats. Journal of Pathology 2000; 190:203-210. 9. Nagata H., Ito M., Cai j., et al. Treatment of cirrosis and liver failure in rats by hepatocyte xenotransplantation. Gastroenterology 2003; 124:422-431. 10. Yoshida H., Tokusashi Y., Lee G. H., Ogawa K. Intrahepatic transplantation of normal hepatocytes prevents Wilson¿s disease in long-evans cinnamon rats. Gastroenterology 1996. 111:1654-1660. 11. Kobayashy et al. Hepatocyte transplantation in rats with descompensated cirrhosis. Hepatology 2000.31:851-857. 12. Gupta et al. Integration and proliferation of transplanted cells in hepatic parenchyma following D-galactosamine-onduced acute injury in F344 rats. Journal of Pathology 2000; 190:203-210. 13. Bilir et al. Hepatocyte transplantation in acute liver failure. Liver transplantation 2000.6:32-40. 14. Strom et al. Transplantation of human hepatocytes. Transplantation Proceedings 1997; 29:2103-2106. 15. Habibullah et al. Human fetal hepatocyte transplantation in patients with fulminant hepatic failure. Transplantation 1994,58:951-977. 16. Fox et al. Treatment of the Crigler-Najjar syndrome type I with hepatocyte transplantation. The New England Journal of Medicine 1998.338:1422-1426. 17. Sokal et al. Hepatocyte transplantation in a 4-year-old girl with peroxisomal biogenesis disease: technique, safety, and metabolic follow-up. Transplantation 2003. 27:735-738. 18. Muraca M., Gerunda G., Neri D. et al. Hepatocyte transplantation as a treatment for glycogen storage disease type 1a. Lancet 2002 ; 359 :317-318. 19. Mir J. El Trasplante Hepático. Generalitat Valenciana ed. 2001. 20. Mitry R.R., Hughes R.D. Aw M.M., et al. Human hepatocyte isolation and relationship of cell viability to early graft function. Cell transplantation 2003; 12:69-74.
