Control de calidad in vivo de constructos de piel humana elaborada por ingeniería tisular
- Autores: José María Jiménez Rodríguez
- Directores de la Tesis: Miguel Alaminos Mingorance (dir. tes.), Jose Miguel Labrador Molina (dir. tes.), Antonio Campos Muñoz (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Ignacio Pérez de Vargas Ferroni (presid.), José Manuel García López (secret.), Ricardo Fernández Valadés (voc.), Pascual Vicente Crespo Ferrer (voc.), Juan Luis Ramos (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
Título: CONTROL DE CALIDAD IN VIVO DE CONSTRUCTOS DE PIEL HUMANA ELABORADA POR INGENIERÍA TISULAR Introducción: Distintas patologías de la piel, incluyendo pérdida de sustancia, heridas, quemaduras, úlceras por presión, etc., han dado lugar a la creación y perfeccionamiento de las técnicas reconstructivas que persiguen unos resultados estéticos y funcionales similares a los de la situación previa al daño. Dichas técnicas ya fueran coberturas con injertos cutáneos autólogos, alogénicos o xenoinjertos así como el uso de colgajos o coberturas biosintéticas han supuesto un avance en el tratamiento de esta patología, capaz de cubrir el defecto primario, permitiendo llevar a cabo cirugías de gran agresividad para el paciente, con unos resultados funcionales y estéticos aceptables. Sin embargo, estas técnicas presentan en determinadas situaciones unas limitaciones, como el déficit o la mala calidad de la zona donante, pacientes con morbilidad añadida los cuales no son candidatos a cirugías agresivas, etc. En la actualidad, no disponemos de sustitutos biológicos histocompatibles capaces de garantizar resultados que superen los obtenidos con las técnicas habituales empleadas y que logren minimizar la morbilidad y secuelas derivadas de los mismos. Ante esta situación, las técnicas de ingeniería tisular, pueden suponer un auténtico avance en el campo de la cirugía reconstructiva al poner en manos del profesional derivados tisulares biocompatibles capaces de sustituir el tejido dañado por otro con características anatómicas, histológicas y funcionales similares a las del tejido primitivo. La ingeniería tisular es una de las áreas de la biotecnología que más se ha desarrollado en los últimos años, debido a su utilidad potencial para la fabricación in vitro de tejidos y órganos para su implante en pacientes necesitados de estos tejidos. Se trata de un área multidisciplinar que aplica los principios de la ingeniería y de las ciencias de la vida para desarrollar sustitutos biológicos que restauran, mantienen o mejoran la función tisular.
Objetivos: A.- Cultivo en laboratorio de los distintos tipos de células de la piel humana (en especial, fibroblastos y queratinocitos) y determinación de las condiciones óptimas de cultivo y expansión celular para dichas células.
B.- Generación en laboratorio de un sustituto de piel humana mediante ingeniería tisular, utilizando biomateriales de fibrina y agarosa y células humanas viables (fibroblastos y queratinocitos).
C.- Evaluación de la viabilidad in vivo de los sustitutos de piel humana artificial mediante implante en ratones inmunodeficientes.
D.- Evaluación histológica de los tejidos artificiales implantados en ratones inmunodeficientes.
E.- Evaluación inmunohistoquímica de los tejidos artificiales implantados en ratones inmunodeficientes Metodología: Las muestras de piel humana se obtuvieron a partir de pequeñas biopsias procedentes de pacientes sometidos a intervenciones en el Servicio de Cirugía Plástica del Hospital Universitario Virgen de las Nieves de Granada. Todos los pacientes incluidos en el estudio dieron su consentimiento previo a la participación en el mismo.
Para separar la dermis del epitelio, las muestras se mantuvieron en una solución estéril con dispasa II a 37ºC. En cuanto al epitelio se utilizó tripsina-EDTA para separar los queratinocitos. Para llevar a cabo la digestión de la matriz extracelular de la dermis de la piel y conseguir la separación de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras se incubaron a 37ºC en una solución estéril de colagenasa tipo I. Para el cultivo de queratinocitos se empleó medio de cultivo selectivo QC rico en factores de crecimiento y para el cultivo de fibroblastos un medio denominado MF, que se trata de un medio de cultivo convencional. Para el desarrollo de los diferentes constructos de piel humana artificial, se utilizó fibrina humana procedente de plasma sanguíneo de donantes sanos, a los cuales se añadió ácido tranexámico (como antifibrinolítico), cloruro cálcico para precipitar la reacción de coagulación de la fibrina y agarosa al 0,1%. Estos sustitutos de piel artificial se implantaron en el dorso de unos ratones atímicos para su evolución in vivo, analizándose los equivalentes cutáneos implantados mediante microscopía óptica y electrónica de transmisión y barrido e inmunofluorescencia.
Resultados: En este trabajo hemos realizado un estudio profundo de la piel artificial generada mediante Ingeniería Tisular. Desde la selección de las células a utilizar para su fabricación, pasando por el análisis de su comportamiento in vitro, hasta un control de calidad de los tejidos implantados en ratones atímicos. Para esto, fue necesario desarrollar diversas técnicas microscópicas y de inmunofluorescencia que nos permitieron evaluar factores tan importantes como la proliferación celular, la existencia de patrones morfológicos de diferenciación, la expresión de citoqueratinas, involucrinas y filagrinas, la angiogénesis y la integración con tejidos del organismo receptor. En su conjunto, todos estos resultados demuestran que la piel artificial obtenida mediante técnicas de Ingeniería Tisular presenta numerosas similitudes, en el epitelio y en el estroma, con la piel humana normal, especialmente cuando está implantada in vivo. Las diferentes pruebas realizadas demuestran la progresiva formación y maduración del epitelio, uniones celulares y matriz extracelular en los sustitutos de piel artificial obtenidos en el laboratorio.
Por todo ello, creemos que nuestro modelo de piel artificial humana fabricado a partir de fibrina y agarosa podría ser útil en el tratamiento de diferentes patologías que afectan la normalidad de la piel.
Conclusiones: 1. La aplicación de los métodos y técnicas descritos en esta Tesis Doctoral permitió aislar y mantener en cultivo los principales tipos de células que constituyen la piel humana: queratinocitos de la epidermis y fibroblastos de la dermis.
2. La utilización de biomateriales de fibrina y agarosa permitió elaborar en laboratorio un sustituto eficiente de piel humana mediante técnicas de Ingeniería Tisular. Estos sustitutos de la piel de espesor completo presentaban una adecuada consistencia, ausencia de contracción del sustituto estromal y una elevada supervivencia de los fibroblastos y queratinocitos en el seno del mismo.
3. La evaluación clínica del sustituto de piel humana obtenido mediante Ingeniería Tisular en un modelo animal demostró la utilidad y la viabilidad de este tipo de tejidos para la reparación quirúrgica de grandes defectos cutáneos de espesor completo. La piel generada en laboratorio mostró adecuados niveles de biocompatibilidad con el receptor y ausencia de cualquier signo de rechazo, dehiscencia o infección. Todos los animales mostraron la aparición de tejido de granulación tras seis días del implante, el cual dio paso a una cicatrización total a partir del vigésimo día.
4. La evaluación histológica de la piel humana artificial implantada en un modelo animal mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión y de barrido, reveló un alto grado de diferenciación tisular de la piel implantada, la cual mostró gran similitud con la piel humana nativa normal. Concretamente, la estructura de los injertos de piel humana artificial fue muy similar a la de la piel normal, existiendo múltiples capas de células epiteliales organizadas en estratos basal, espinoso, granuloso y córneo, así como un estroma rico en fibroblastos y matriz extracelular, con abundantes fibras de colágeno. De igual modo, desde el décimo día del implante se apreciaron numerosos vasos sanguíneos neoformados en el estroma del injerto de piel humana.
5. La evaluación mediante inmunofluorescencia del sustituto de piel humana obtenida mediante Ingeniería Tisular e implantado in vivo en un modelo animal puso de manifiesto la expresión de numerosos marcadores de la piel humana normal, destacando la expresión de citoqueratinas, involucrinas y filagrinas. Este hecho sugiere que los sustitutos de la piel humana generados en laboratorio podrían ser funcionalmente análogos a la piel humana normal y, por tanto, abren la puerta a un posible uso clínico de los mismos.
