Resumen de Caracterización termodinámico-estructural de la estabilidad de dominios de pdz y análisis de su especificidad de unión mediante liberías de expresión en fagos
El trabajo desarrollado en esta Tesis Doctoral tenía como objetivo el estudio detallado del equilibrio conformacional del tercer dominio PDZ de la proteína PSD95 (PDZ3-PSD95), con el interés de abordarlo por ser un dominio modular de una proteína hub, además de por ser el primer estudio termodinámico-estructural del equilibrio conformacional que se ha hecho hasta la fecha de un dominio PDZ. Por otro lado, también se ha tratado de desarrollar un protocolo mediante la metodología de expresión en fagos (phage display) para poder avanzar en el conocimiento de la especificidad de unión de ligandos de los dominios PDZ, lo que permitirá predecir sus propiedades funcionales a partir únicamente de su secuencia aminoacídica.
De forma más detallada, el trabajo se resume en:
I. Se clonó y purificó el dominio PDZ3-PSD95, al cual se le buscaron condiciones de cristalización mediante el uso de las técnicas de gota colgante y de contradifusión. Una vez obtenidos los cristales, se difractaron y se resolvió la estructura en dos de las condiciones usadas.
II. Se realizó un estudio del equilibrio conformacional del dominio PDZ3-PSD95 mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) en condiciones de pH neutro. Puesto que los resultados de DSC revelaron la presencia de un intermedio de equilibrio que presenta fenómenos de asociación-disociación, según se dedujo a partir de la dependencia de las trazas calorimétricas en función de la concentración, se hicieron experimentos de dispersión dinámica de la luz (DLS), cromatografía de exclusión molecular (SEC), dicroísmo circular (CD) y fluorescencia de ANS y ThT para caracterizar dicho intermedio. Además, éste resultó ser un precursor de formación de estructuras anulares y fibrilares, tal y como revelaron las diferentes espectroscopias y las micrografías realizadas mediante el microscopio electrónico de transmisión (TEM).
III. Se hizo, asimismo, un estudio paralelo al descrito en el punto II del dominio PDZ3-PSD95 a valores ácidos de pH para profundizar en las características moleculares de los procesos observados. Se descubrió que el intermedio se desestabiliza energéticamente, no poblándose significativamente cuando el pH es menor de 3.5. Esto apuntaría a los residuos aspartato y/o glutamato como los responsables de dicho comportamiento, puesto que tienen un valor de pKa alrededor de ese valor de pH.
IV. Se clonó y purificó el dominio PDZ3-PSD95 sin su hélice a3. Dicha hélice es un elemento de conexión entre el dominio PDZ3-PSD95 y el dominio SH3 de la proteína PSD95 y ya se había demostrado en estudios previos que es un elemento regulador de las características de unión de este dominio, hecho que se comprobó en esta Tesis Doctoral mediante calorimetría isotérmica de titulación (ITC). Se realizaron experimentos en paralelo a los realizados con el dominio PDZ3-PSD95 para evaluar el papel de la hélice a3 en el plegamiento del dominio.
V. Finalmente, se describe en esta Tesis Doctoral el protocolo desarrollado para intentar establecer la especificidad de unión de los dominios PDZ a partir del único conocimiento de su secuencia aminoacídica mediante la metodología de expresión en fagos. Para ello, se eligió como sistema arquetípico el dominio PDZ de la proteína Erbin (PDZ-Erbin), mediante el cual se generó una librería en la cual se mutaron de manera aleatoria todos los residuos responsables de interaccionar con el aminoácido presente en la posición 0 del ligando. Se eligieron como moléculas diana para las selecciones veinte variantes del ligando de alta afinidad para PDZ-Erbin, TGWETWV, las cuales se diferenciaban cada una en el aminoácido presente en su posición 0. Seguidamente se seleccionaron los mutantes del dominio PDZ-Erbin de la librería frente a cada una de las variantes del péptido, y se secuenciaron aquellos que se unieron a cada uno de los péptidos.
Las conclusiones más importantes del trabajo presentado en esta Tesis Doctoral se enumeran a continuación:
1. Las estructuras del dominio PDZ3-PSD95 han sido resueltas por difracción de rayos X a 1.4 Å de resolución. Éstas revelaron un cambio conformacional de los residuos presentes en la hélice a3 respecto a las estructuras conocidas de dicho dominio, las cuales fueron obtenidas a partir de secuencias del dominio PDZ3-PSD95 que contenía un artefacto de clonación que no pertenece a la secuencia natural de la proteína PSD95.
2. En dichas estructuras se observó la presencia de un anillo de succinimida en la posición Asp332, lo cual implica una reducción de la flexibilidad del giro entre las cadenas b2 y b3 del dominio donde se encuentra ese resto, siendo de esta forma la región más rígida en el global de la estructura. Este anillo de succinimida favorece la formación del cristal y participa directamente en los contactos cristalinos.
3. El dominio PDZ3-PSD95 presenta en su mecanismo de desplegamiento un intermedio de equilibrio que muestra fenómenos de asociación, tal y como revelaron los experimentos de CD, DSC, DLS y SEC. Además, los resultados experimentales apuntan a que el grado de asociación del intermedio corresponde a un trímero, aunque también podría ser una mezcla de dímeros, trímeros y tetrámeros, que podría compendiarse estadísticamente a un trímero.
4. Este intermedio de equilibrio es además un precursor de estructuras anulares y fibrilares, según se observó mediante TEM y la unión a Congo Red, ANS y ThT. Además, desde un punto de vista cinético no se detecta la presencia de una fase de retardo (lag phase), la cual se ha observado en la mayoría de los procesos de fibrilación de otras proteínas.
5. El proceso de formación de estas estructuras supramacromoleculares presenta un alto carácter reversible. La reversibilidad en la formación de estas estructuras a partir del intermedio se puede deber a la mayor estabilidad del estado nativo a temperatura ambiente respecto a la de aquellas, en contraposición a la mayoría de los ejemplos descritos hasta la fecha.
6. Las conclusiones 4 y 5, junto con la formación de estructuras anulares de forma reversible sin la presencia de membranas o disolventes orgánicos, como habían sido observadas hasta la fecha, hacen del dominio PDZ3-PSD95 un modelo más que interesante para la caracterización y estudio de los mecanismos de agregación relacionados con el plegamiento de las proteínas.
7. A valores de pH menores de 3.5 el intermedio de plegamiento observado en el dominio PDZ3-PSD95 se desestabiliza energéticamente. A esos valores de pH, además de que no se forman estructuras anulares, la formación de fibras es más rápida e irreversible que la que se da a pH neutro presentándose en su mecanismo una fase de retardo. La irreversibilidad se debería a la mayor estabilidad de las fibras con respecto al estado nativo.
8. El estudio equivalente del dominio PDZ3-PSD95 sin su hélice a3, en donde están algunos de los posibles restos responsables de las diferencias descritas en función del pH, reveló que al eliminar dicha hélice se produce una estabilización del intermedio. El intermedio no forma estructuras anulares, aunque sí fibrilares, pero lo hace más rápidamente y de forma irreversible. Nuevamente, al bajar el pH, el intermedio se desestabiliza energéticamente, de forma paralela a como ocurre en la construcción con la hélice.
9. Todos estos resultados nos hacen postular una organización estructural para el intermedio de plegamiento del dominio PDZ3-PSD95 que presentaría un contenido en estructura secundaria semejante al del estado nativo, pero donde algunos elementos estructurales, principalmente las cadenas b3 y b5 podrían encontrarse más o menos desorganizadas.
10. Los resultados obtenidos a partir de las selecciones de la librería del dominio PDZ-Erbin confirmaron que la metodología de expresión en fagos es una herramienta muy potente para el estudio de la especificidad de unión de dominios PDZ, debido a su previamente conocida potencialidad a la que cuando además se incluyó un proceso de competición generó la obtención de variantes más selectivas con respecto a sus moléculas diana.
