Resumen de Identificació de gens associats a la transició epiteli-mesènquima induïda pels factors de transcripció E47 i Snail en les cèl·lules epitelials MDCK. Mecanisme de l'activació transcripcional de MMP-9 i Id-1 induïda per E47 i Snail
Els carcinomes són tumors dorigen epitelial que constitueixen aproximadament el 90% dels tumors humans. La progressió tumoral implica diferents etapes: creixement del tumor primari, invasió local, intravasació, extravasació i proliferació de les cèllules tumorals en un nou òrgan on formen un tumor secundari o metàstasi. Són, precisament, les metàstasis la principal causa de mort dels malalts de càncer.
La invasió local dels carcinomes requereix la pèrdua de lexpressió o de la funció de la molècula dadhesió cadherina E, la qual és un supressor dinvasió. A més, el procés dinvasió també va acompanyat de la pèrdua daltres marcadors epitelials, de ladquisició de marcadors mesenquimals i de laugment de les propietats migratòries i invasives. Aquests canvis tenen un gran parallelisme amb la conversió fenotípica que té lloc durant el desenvolupament embrionari i que sanomena transició epiteli-mesènquima (TEM). El principal mecanisme que regula el silenciament de la cadherina E és la repressió transcripcional, i recentment shan caracteritzat diversos factors de transcripció que a través de la seva interacció amb les caixes E (de seqüència CANNTG) del promotor de la cadherina E reprimeixen la seva expressió: Snail, Slug, E47, Twist, ZEB-1 i ZEB-2.
Lexpressió estable de Snail o E47 en les cèllules epitelials Madin Darby Canine Kidney (MDCK) indueix un procés de TEM complet, però no es coneix el mecanisme. Moltes de les alteracions que es donen en la TEM poden ser explicades com a conseqüència de la repressió de la cadherina E, però altres events cellulars, independents de la dissociació cellular, contribuirien també a la iniciació i completació del procés. Per aquest motiu, en aquesta Tesi sha realitzat lanàlisi de lexpressió gènica diferencial mitjançant RAP-PCR i microarrays de cDNA per identificar gens implicats en el procés de TEM induït per Snail o E47. Així, shan trobat gens que codifiquen per proteïnes relacionades amb diverses funcions cellulars com cicle cellular, apoptosi, metabolisme o senyalització, però el grup majoritari és el de gens implicats en migració i invasió (adhesió cellular, citoesquelet, matriu extracellular MEC- i proteases de MEC). Aquest estudi mostra a més que lexpressió estable de Snail o E47 en les cèllules MDCK indueix programes genètics en part comuns i en part específics, suggerint el paper diferencial daquests dos factors de transcripció en la progressió tumoral.
Per altra banda, sha estudiat el mecanisme que regula la sobreexpressió de la metalloproteasa MMP-9 i del factor de transcripció Id-1 que es dóna en la TEM induïda tant per Snail com per E47. Lactivació transcripcional de MMP-9 és induïda per Snail i E47 de forma indirecta i mediada per altres factors de transcripció tals com Ets-1 i Sp1 que suneixen a la regió proximal del promotor formant un multicomplexe, i NFkB/p65 que interacciona amb una regió més distal. En canvi, lactivació transcripcional dId-1 és regulada principalment a través de la segona caixa E del promotor humà que interacciona amb E47. Pel que fa a Snail, no hem pogut confirmar si suneix directament a aquest element o indueix lexpressió dun altre factor de transcripció capaç dunir-shi. També és important la caixa GC adjacent a la caixa E que recluta Sp1. Tant lactivació de MMP-9 com dId-1 és regulada per la via Erk/MAPK (activada per Snail i E47) que fosforila almenys Sp1. Aquests resultats juntament amb lexpressió coneguda de Snail i E47 en línies cellulars de carcinoma podrien explicar la sobreexpressió de MMP-9 i Id-1 en molts tumors.
_________________________________________________ Carcinomas are tumors of epithelial origin that comprise approximately 90% of human tumors. Tumor progression is a multistep process: growth of primary tumor, local invasion, intravasation, extravasation and proliferation of malignant cells in a new organ where they form a secondary tumor or metastasis. Metastasis are the main cause of death of cancer patients.
Local invasion of carcinomas requires loss of E-cadherin expression or function, which is an adhesion molecule and a well established invasion supressor. In addition, invasion process is accompanied by loss of other epithelial molecules, acquisition of mesenquimal markers and gain of migratory and invasive properties. These changes have many parallels with the phenotypic conversion that takes place during embryonic development known as epithelial-mesenquimal transition (EMT). The main mechanism that regulates E-cahderin silence is transcripcional repression, and recently several transcription factors have been characterized as E-cadherin repressors through their interaction with the E-boxes (of sequence CANNTG) of the promoter: Snail, Slug, E47, Twist, ZEB-1 and ZEB-2.
Stable expression of Snail or E47 in Madin Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells induce a complete EMT, but the mechanism that govern it is not known yet. Some of the alterations that occur during EMT can be explained as a consequence of E-cadherin repression, but other cellular events, independent from cellular dissociation, may contribute to the initiation and completion of the process. For this reason, in this Thesis we made a differential expression analysis by RAP-PCR and cDNA microarrays to identify genes implicated in Snail and E47 induced EMT. Thus we found genes related to different cellular functions such as cellular cycle, apoptosis, metabolism and signaling, but the great group was composed by genes implicated in migration and invasion (cellular adhesion, cytoskeleton, extracellular matrix EMC- and EMC proteases). This study shows that Snail or E47 expression in MDCK cells induce common and specific genetic programs, suggesting a differential role for these transcription factors in tumor progression.
On the other hand, we studied the mechanism that regulates metalloprotease MMP-9 and transcription factor Id-1 upregulation in Snail and E47 induced EMT. Snail and E47 induced activation of MMP-9 is indirect and mediated by other transcription factors such as Ets-1 and Sp1 that bind to the proximal region of promoter forming a multicomplex, and NFkB/p65 that interacts with a more distal region. On the contrary, Id-1 transcriptional activation is regulated mainly through the second E-box of human promoter that recruits E47. At the moment, we have not been able to confirm whether Snail binds directly to this element or it induces the expression of another factor that interacts with the E-box. It is also important the GC-box adjacent to this E-box that binds Sp1. Either MMP-9 or Id-1 activation are regulated by Erk/MAPK pathway(activated by Snail and E47) that phosphorilates at least Sp1. These results together with known expression of Snail and E47 in carcinoma cell lines may explain MMP-9 and Id-1 upregulation in tumors.
