In vivo role of DNA polymerases lambda and mu in Genome Stability

• Autores: Ana Aza Montoya
• Directores de la Tesis: Luis Blanco Dávila (dir. tes.), Gloria Terrados Aguado (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2014
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: José Fernández Piqueras (presid.), Cristina Tomás-Zapico (secret.), Ana Bonnin Bioslada (voc.), Antonio Bernad Miana (voc.), Enrique Viguera Mínguez (voc.)
• Materias:
  • Ciencias médicas
    • Ciencias clínicas
      • Genética clínica
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • El mantenimiento de la estabilidad genómica es crítico para la supervivencia celular y una fiel transmisión del material genético a las células hijas. Las roturas de doble cadena de DNA (DSB) son una de las lesiones más tóxicas y mutagénicas que pueden experimentar las células humanas. Una única rotura puede dar lugar a una pérdida de más de 100 millones de pares de bases de información genética, mientras que una rotura no reparada o reparada incorrectamente en células de mamífero puede originar translocaciones cromosómicas y carcinogénesis. Dos de las principales vías implicadas en reparación de roturas de doble cadena son: Unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR). En la reparación de DNA por NHEJ, la homología en la secuencia está ausente o se da solo en unos pocos nucleótidos. Existen evidencias que sostienen que la DNA polimerasa ¿ y la DNA polimerasa ¿, ambas miembros de la familia de polimerasas X en mamíferos, tienen papeles no redundantes en NHEJ, debido a sus diferentes grados de complementariedad que pueden aceptar como micro homología. En esta tesis se ha continuado el estudio bioquímico de las propiedades de Pol¿. Proponemos un modelo de expansión de dinucleótidos mediado por Pol¿ en función del contexto de secuencia. En este modelo Pol¿ requiere diferentes substratos de DNA, incluidos aquellos que pueden mimetizar los intermediarios de NHEJ. Además, nuestro estudio mecanístico señaló los residuos His329 y Arg387 de Pol¿ humana como responsables de la regulación de la expansión de nucleótidos que ocurre durante las transiciones de reparación de DNA, o bien promoviendo o bien bloqueando, respectivamente, mediante polimeración iterativa. Hemos demostrado que la ausencia de Pol¿ puede provocar una reparación menos eficiente en NHEJ pero más conservadora en el cerebro de ratones de edad avanzada. Utilizando extractos de tejidos de ratones deficientes en Pol¿ demostramos una reducción en la tasa de error en la síntesis en los ratones Pol¿-/- cuando soportan lesiones de tipo 8oxoG. Hemos estudiado la posible relación entre Pol¿ y la enfermedad de Huntington utilizando modelos murinos. La enfermedad de Huntington (HD) es un desorden neurodegenerativo autosómico dominante y progresivo causado por una expansión de repetición de poliglutamina en la región codificante del gen de la Huntingtina (Htt). Combinamos ratones R6/1(N-mutante Htt) con ratones deficientes de Pol¿. El análisis somático de la expansión revela que Pol¿ está implicada en este proceso, ya que los ratones R6/1;Pol¿-/- muestran una menor expansión somática de CAG e incluso lo transmiten a sucesivas generaciones. Además, el área de las inclusiones de huntingtina está reducida en los ratones R6/1;Pol¿-/-, pero contrariamente a lo esperado, la prevención de esta expansión no disminuye la progresión de la enfermedad en características como la deficiencia motora o la pérdida de peso. También hemos investigado y evaluado la contribución de las DNA polimerasas ¿ y ¿ en la reparación de DSB vía NHEJ en un contexto celular. Para ello, desarrollamos un modelo de ratón deficiente en ambas polimerasas, el cual era tanto viable como fértil. Obtuvimos fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) deficientes en Pol¿, Pol¿ o en ambas (Doble KO). Analizamos la sensibilidad de estos MEFs frente a diferentes drogas capaces de dañar el DNA: desde agentes oxidantes (TBH, H2O2) a análogos de nucleósidos utilizados en medicina como agente quimioterapéuticos (Citarabina, Fludarabina, Etopósido), así como su supervivencia frente a radiación ionizante. Los MEFs procedentes del doble KO son más sensibles a estos agentes de daño que los MEFs control procedentes de ratones silvestres, indicando una mayor inestabilidad genómica debido a la ausencia de estas dos polimerasas. Evaluamos el efecto del etopósido en nuestros MEFs a través del ensayo de formación de focos y citometría de flujo: los MEFs doble KO presentan un daño persistente en el DNA en tiempo y el ciclo celular se ve drásticamente afectado provocando un mayor arresto en G2/M. También analizamos la senescencia celular en estas células, observando que los MEFs doble KO entran en senescencia antes que los MEFs control. Para entender más a fondo las diferencias estructurales y funcionales entre la Pol¿ y Pol¿ humanas, que les permiten ser complementarias en su rol en reparación de DSB vía NHEJ, desarrollamos varias quimeras intercambiando dos dominios específicos: ¿Loop 1¿, presente de manera específica en Pol¿ y TdT confiriendo un rol muy importante a Pol¿ tanto en NHEJ como en la actividad transferasa terminal, y un dominio ¿nail¿ presente en Pol¿ que interactúa con la hebra molde. En esta tesis hemos podido evaluar in vivo estas quimeras confirmando la importancia de estos residuos reconociendo la secuencia en el contexto de NHEJ. Demostramos también que la fosforilación de ciertos residuos específicos aumenta la actividad de las polimerasas ¿ durante NHEJ The maintenance of genomic stability is critical for cell survival and the faithful transmission of genetic material to daughter cells. The DNA double strand break (DSB) is one of the most toxic and mutagenic DNA lesions experienced in human cells: a single DSB can potentially lead to loss of more than 100 million base pairs of genetic information, while unrepaired or incorrectly repaired DSBs in mammalian cells can lead to large chromosomal translocations and carcinogenesis. Two major pathways have evolved to repair DSBs: non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). In the DNA repair by NHEJ, sequence homology is absent or restricted to few nucleotides. Evidences support that DNA polymerase ¿ and DNA polymerase ¿, both members of the mammalian Pol X family, have complementary, non-redundant roles in NHEJ, due to their different degree of complementarity that they can accept as micro-homology. I continued the biochemical study of the properties of Pol¿. We proposed a model for Pol¿-mediated dinucleotide expansion as a function of the sequence context. In this model, Pol¿ requires an initial dislocation that must be subsequently stabilized, to generate large sequence expansions at different DNA substrates, including those that mimic NHEJ intermediates. Moreover, our mechanistic studies pointed at human Pol¿ residues His329 and Arg387 as responsible for regulating nucleotide expansions occurring during DNA repair transactions, either promoting or blocking, respectively, iterative polymerization. We have demonstrated that the absence of Pol¿ could provoke a less efficient but more conservative NHEJ repair in the brain of old mice. By using tissue extracts from mice deficient in Pol¿, we demonstrated a reduced error-prone synthesis in the Pol¿-KO mice when tolerating 8oxoG lesions. We¿ve been working in the possible relationship between Pol¿ and Huntington¿s disease using mouse models. Huntington¿s disease (HD) is an autosomal dominant progressive and fatal inherited neurodegenerative disorder caused by a polyglutamine repeat expansion (CAG) in the coding region of the Huntingtin (Htt) gene. We combined R6/1(N-mutant Htt) mice with Pol¿ knockout mice. Analysis of somatic expansion reveals that Pol¿ is implicated in this process, since R6/1;Pol¿-/- mice showed lower CAG repeat somatic expansion and even contraction transmitted to successive generations. In addition, the area of huntingtin inclusions is reduced in R6/1;Pol¿-/- mice, but contrary to expect, prevention of this expansion does not preclude disease progression such as motor impairment or weight loss. We have investigated and evaluated the contribution of DNA polymerases ¿ and ¿ in the repair of DSB via NHEJ in a cellular context. For thus, we have developed a mouse model deficient in both polymerases, which is viable and fertile. We have obtained Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) deficient in ether Pol¿, Pol¿ or in both (Double KO). We analyzed the sensitivity of these MEFs to different drugs related to DNA damage: from oxidative agents (TBH, H2O2) to nucleoside analogous used in medicine as a chemotherapeutical agents (Cytarabine, Fludarabine, Etoposide). Ionizing radiation survival, a well-known agent that induces DNA damage, was also tested in these MEFs. Double KO MEFs are more sensitive to these drugs than wild type MEFs, indicating a major genetic instability due to the absence of both polymerases. We have evaluated the effect of etoposide (a drug which produces DSB) in our MEFs through foci assay and flow cytometry analysis: Double KO MEFs present persistent DNA damage in time and cell cycle is drastically affected provoking major arrest in G2/M. We also analyzed cell senescence in these MEFs. We observed that Double KO MEFs entry in senescence earlier than wt MEFs. To further understand the structural and functional differences between human Pol¿ and Pol¿ that allow them to be complementary in their role in DSB repair via NHEJ, we have developed various chimeras interchanging two specific domains: ¿Loop 1¿, specifically present in Pol¿ and TdT which confers an important role in Pol¿¿s NHEJ and terminal transferase activity; and a ¿nail¿ domain present in Pol¿ that interacts with the template strand. Here we evaluated in vivo these chimeras confirming the importance of these residues recognizing the sequence in NHEJ context. We have also demonstrated that the phosphorylation of specific residues enhances Pol¿¿s activity during NHEJ