Resumen de Caracterització molecular del gen GH1 en poblacions control i patològiques, patrons dexpressió en leucòcits de sang perifèrica i estudi funcional de proteïnes mutants detectades en pacients
El retard de creixement pot ser secundari en un percentatge indeterminat de pacients a un problema genètic. En aquest treball sanalitza el gen de lhormona de creixement (GH1) i sestudien els canvis en la seqüència que produeixin un ARN missatger anòmal o una proteïna que no sigui funcional. Sha estudiat el mapa polimòrfic del gen GH1 en una població control (n=307), per definir el mapa de SNPs. Alhora sha buscat un model en el qual poder estudiar lexpressió daquest gen. Sha aïllat l'ARN de leucòcits de sang perifèrica tant de pacients com de controls, i sha amplificat el missatger de GH1. També sha posat a punt un model cellular en el qual poder estudiar la bioactivitat de les proteïnes recombinants portadores dels canvis detectats en pacients (Phe25Tyr i Val173Leu).
Les conclusions del treball han estat les següents:
1. Els nostres resultats han confirmat i ampliat la descripció de la variabilitat estructural del gen GH1. Han permès descriure el mapa complet per primera vegada, en una població adulta amb talla normal, compresa entre -2 i +2 SDS (n=307).
2. En les poblacions amb retard crònic de creixement (n=728) shan detectat en un 11% de pacients canvis en la seqüència del gen GH1 diferents dels SNPs del mapa control. Entre els canvis, l'11,3% correspon a canvis puntuals dun aminoàcid (1% del total de pacients índex).
3. Lexpressió de GH1 en leucòcits de controls no és constitutiva ni constant en quant a les variants de splicing observades. Aquesta metodologia no permet detectar de forma fiable mutacions en pacients. En canvi, ens ha permès confirmar lexpressió de mutants com en el cas duna substitució predictora de canvi daminoàcid, així com descartar o confirmar anomalies de splicing en allels portadors de canvis intrònics.
4. La utilització deines informàtiques ha permès realitzar una aproximació teòrica a lefecte que dos canvis daminoàcid (Phe25Tyr i Val173Leu) a la proteïna GH tenen sobre la seva estructura i interacció amb GHR. Lanàlisi dhomologia de les proteïnes mutants amb les dels altres gens del clúster de la GH ha permès concloure que la substitució Phe25Tyr es pot haver generat per recombinació gènica amb el gen GH2, mentre que no és el cas per a la proteïna amb el canvi Val173Leu.
5. Les proteïnes recombinants obtingudes al laboratori (WT i mutants) han estat aptes per al seu estudi in vitro (inmunoreactivitat, proliferació cellular i bioactivitat).
6. Les GHs mutants Phe25Tyr i Val173Leu presenten una inmunoactivitat i una bioactivitat disminuïdes. Els models cellulars de les línies HepG2 i C-28/I 2 no han permès obtenir resultats, mentre que el model de cultiu primari de condròcits fetals humans ha permès detectar que les dues GHs mutants estimulen amb menor intensitat la transcripció de IGF1 mentre que provoquen un augment en lexpressió de GHR i IGF1R.
7. El canvi daminoàcid Phe25Tyr incorporat en un allel de GH1 portat en heterozigosi per dues famílies no relacionades es manifesta com a retard de creixement durant la infantesa que sacompanya de resposta deficitària de secreció de GH i disminució de IGF1. La resposta al tractament amb GH és adequada i permet recomanar el tractament fins al final del creixement. El canvi Val173Leu detectat en una pacient amb talla baixa i RIUC, sense dèficit aparent de GH, permet suggerir que la detecció precoç de mutacions al gen GH1 quan la secreció aparenta ser normal, permetria un tractament més precoç que hagués millorat el seu pronòstic de talla final. Lanàlisi dels haplotips complets de GH1 permet interpretar lefecte de la combinació de mutacions a la proteïna amb els genotips per als SNPs.
" TITLE OF THE THESIS: "MOLECULAR CARACTERITZATION OF GH1 GENE IN CONTROL AND PATHOLOGIC POPULATIONS, EXPRESSION PATTERNS IN PERIPHERAL BLOOD LEUCOCYTES AND FUNCTIONAL STUDY OF MUTANT PROTEINS DETECTED IN PATIENTS" SUMMARY: The growth delay can be a secondary factor in front of a genetic problem in an indeterminate percentage of patients. In this work, it is analyzed the gene of growth hormone (GH1) and it is studied the changes in the sequence that produce an anomalous messenger ARN or a protein that is not functional. The polymorphic map of gene GH1 has been studied in a control population (n=307), to define the map of SNPs. At the same time, a model has been looked for, in which it could be possible to study the expression of this gene. The ARN of leucocytes of peripheral blood of patients and controls has been isolated, and the GH1 messenger has been amplified. Moreover, we have worked in a cellular model that allows us to study the bioactivity of recombinant proteins carrying the changes detected in patients (Phe25Tyr and Val173Leu).
The conclusions of the work have been the following ones:
1. Our results have confirmed and extended the description of the structural variability of gene GH1. They have allowed us to describe the complete map for the first time, in an adult population with normal stature, between -2 and +2 SDS (n=307).
2. In the populations with chronic growth delay (n=728) in an 11% of the patients, changes have been detected in the sequence of gene GH1 different from the SNPs of the map control. Within these changes, 11.3% correspond to precise changes in an amino acid (1% of the total of index patients).
3. The expression of GH1 in leukocytes of controls is neither constitutive nor constant as far as the observed variants of splicing. This methodology does not allow detecting without doubt the mutations in patients. However, it has allowed us to confirm the expression of mutants as in the case of a predicting substitution of change in amino acid, as well as discarding or confirming anomalies of splicing in carrying alleles of intronic changes.
4. The use of computer tools has allowed us to make a theoretical approach to the effect that two changes in amino acid (Phe25Tyr and Val173Leu) in protein GH have on their structure and interaction with GHR. The homology analysis of mutant proteins with those of the other genes of the cluster of the GH has allowed us to conclude that the Phe25Tyr substitution can have been generated by genic recombination with gene GH2, whereas it is not the case for the protein with the Val173Leu change.
5. The recombinant proteins obtained in the laboratory (WT and mutants) have been suitable for their study in vitro (inmunoreactivity, cellular proliferation and bioactivity).
6. The mutant GHs Phe25Tyr and Val173Leu show a diminished inmunoactivity and bioactivity. The cellular models of lines HepG2 and C-28/I2 have not allowed us to obtain results; in contrast, the model of primary culture of human foetal chondrocytes has allowed us to detect that the two mutant GHs stimulate with smaller intensity the IGF1 transcription and they cause an increase in the expression of GHR and IGF1R.
7. The change of Phe25Tyr amino acid incorporated in one allele of GH1 taken to heterozygosity by two non-related families is shown as growth delay during childhood accompanied by deficiency secretion answer of GH and diminution of IGF1. The response to the treatment with GH is suitable and allows us to recommend the treatment until the end of the growth. The Val173Leu change detected in a patient with short stature and RIUC, without apparent GH deficiency, allows us to suggest that precocious detection of mutations in gene GH1 when the secretion pretends to be normal, would allow a precocious treatment that would have improved its prognosis of final stature. The analysis of the complete haplotypes of GH1 allows us to interpret the effect of the combination of mutations in the protein with the genotypes for the SNPs. "
