Resumen de Nuevos sistemas biocatalíticos para la formación de enlaces C-C. Diseño, caracterización y aplicación sintética de un enzima de fusión quinasa-aldolasa

Laura Iturrate Montoya

• Índice Abreviaturas...".5 ABSTRACT..."......7 INTRODUCCIÓN...".."..9 Aldolasas...".."...............12 Aldolasas dependientes de dihidroxiacetona fosfato"...................15 Estrategias alternativas a la utilización de DHAP".".."....18 Síntesis química de DHAP".".".."."."."."."....20 Síntesis enzimática de DHAP"."."."."22 Enzimas de fusión en biotecnología"...27 Diseño de una proteína de fusión".27 Métodos de obtención de proteínas de fusión "30 Aplicaciones biotecnológicas de las proteínas de fusión"...33 OBJETIVOS..."..39 MATERIALES Y MÉTODOS...2.43 Materiales".45 Métodos"47 Metodologías generales"..47 Sistema multienzimático acoplado para la formación estereoselectiva de enlaces C-C"49 Obtención de la proteína L-rhamnulosa-1-fosfato aldolasa de E. coli"....49 Obtención de la proteína L-fuculosa-1-fosfato aldolasa de E. coli"...52 1 Ensayos de actividad"53 Síntesis de sustratos no comerciales: L-lactaldehído, L-rhamnulosa- 1-fosfato y L-fuculosa-1-fosfato.........................................................................53 Valoración de las actividades L-rhamnulosa-1-fosfato aldolasa y Lfuculosa- 1-fosfato aldolasa"55 Actividad dihidroxiacetona quinasa"..55 Ensayos de valoración"56 Valoración DHAP/aldol"..56 Valoración DHAP/DHA"..57 Sistema multienzimático acoplado para la síntesis de enlaces C-C"...57 Reacciones en un paso (one-pot/one-step)"58 Reacciones en dos pasos (one-pot/two-steps)".59 Enzima de fusión dihidroxiacetona quinasa - fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa.

  Obtención de la proteína fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa de Staphylococcus carnosus".59 Obtención de la proteína de fusión quinasa-L-aldolasa (DLF)".62 Ensayos de actividad!65 Dicroísmo circular!65 Determinación de parámetros cinéticos"66 Estudio del !efecto de proximidad"de los centros activos en el enzima de fusión1..66 Aplicación sintética del enzima de fusión DLF para la reacción aldólica a partir de DHA y un aldehído1.67 Determinación estructural mediante Resonancia Magnética Nuclear"...67 RESULTADOS".71 Sistema multienzimático acoplado para la formación estereoselectiva de enlaces C-C"...73 Estudio de la aplicabilidad sintética del sistema multi-enzimático acoplado para la síntesis de enlaces C-C"78 Reacciones en un único paso (one-pot/one-step)"78 Reacciones en dos pasos (one-pot/two-steps)"81 2 Enzima de fusión dihidroxiacetona quinasa " fructosa 1,6-bisfosfato aldolasa".83 Diseño y obtención del enzima bifuncional quinasa-aldolasa".84 Diseño del enzima bifuncional quinasa-aldolasa"84 Clonaje y sobreexpresión de la FBPA de S. carnosus"88 Clonaje y sobreexpresión de la proteína de fusión"89 Caracterización estructural del enzima de fusión"..92 Estructura primaria"..92 Estructura secundaria298 Estructura cuaternaria2"..104 Estudio de la estabilidad térmica del enzima de fusión"..104 Caracterización funcional".113 Determinación de parámetros cinéticos".113 Estudio del efecto de la fusión en la transferencia de sustrato..115 Aplicación sintética del enzima de fusión DLF"..117 Aplicación sintética de la DLF con regeneración in situ de ATP"119