Resumen de Unraveling the Compulsive Phenotype through Schedule-Induced Polydipsia: Comorbidity, Glutamate-Modulators, and Genetics Biomarkers

Ángeles Francisca Prados Pardo

• español

  La compulsividad se caracteriza por comportamientos persistentes, inflexibles y excesivos que tienen como objetivo evitar consecuencias adversas y que dependen de reglas rígidas. Es el síntoma principal del trastorno obsesivo-compulsivo (TOC), que afecta al 2-3 % de la población, considerado un trastorno crónico e incapacitante. Además, el comportamiento compulsivo se observa en varios trastornos neuropsiquiátricos como la ansiedad, la depresión, la fobia específica y la esquizofrenia. Por lo tanto, se ha considerado un rasgo transdiagnóstico que debe estudiarse siguiendo un enfoque dimensional, como indican los Criterios de Dominio de Investigación del Instituto Nacional de Salud Mental de Estados Unidos (NIMH RDoC, por sus siglas en inglés) y la Hoja de Ruta para la Investigación en Salud Mental en Europa (ROAMER, por sus siglas en inglés). Estos nuevos criterios diagnósticos han resultado en una reclasificación por parte del DSM-5 (Asociación Americana de Psiquiatría, 2013) y el CIE-11 (Organización Mundial de la Salud, 2018), que ahora clasifican el TOC como el trastorno central de los llamados Trastornos Obsesivo-Compulsivos y Relacionados (OCRD, por sus siglas en inglés). Investigaciones futuras podrían ayudar a comprender las alteraciones neuroconductuales relacionadas con la compulsividad y sus implicaciones en los diferentes trastornos. La compulsividad no es un fenómeno unitario, por lo que la heterogeneidad de los síntomas compulsivos puede contribuir a que la eficacia del tratamiento sea muy variable. Se ha observado que aproximadamente un 40 % de los pacientes no responden con éxito a los tratamientos psicofarmacológicos clásicos, que se basan principalmente en los inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS). Sin embargo, estudios clínicos muestran que la modulación de la señal glutamatérgica, mediante psicofarmacoterapia, puede ser beneficiosa para la mejora del control inhibitorio. En este sentido, un metaanálisis sobre estudios genéticos en poblaciones clínicas, señaló que distintos polimorfismos genéticos de los receptores 5-HT2A de la serotonina y mGlu2 del glutamato se asocian con una mayor vulnerabilidad al desarrollo de TOC. Por lo tanto, un posible objetivo farmacológico para modular la compulsividad en los OCRD sería el heterodímero que forman el receptor de serotonina 5-HT2A y el receptor de glutamato mGlu2.

  La presente tesis doctoral investiga las bases neuroconductuales de la compulsividad a través de un fenotipo compulsivo de ratas seleccionadas mediante Polidipsia Inducida por Programa (SIP, por sus siglas en inglés). La SIP induce a las ratas a beber de manera excesiva y persistente, a través de un programa de refuerzo intermitente durante 20 sesiones, permitiendo la selección de ratas compulsivas altas bebedoras (HD, por sus siglas en inglés) y ratas no compulsivas bajas bebedoras (LD, por sus siglas en inglés) en función de su adquisición en la SIP. Los principales objetivos de la tesis doctoral son: (1) caracterizar el fenotipo compulsivo seleccionado a través de SIP, mediante la identificación de conductas alteradas y procesos cognitivos ligados a trastornos comórbidos con TOC en ratas HD; (2) reducir el comportamiento compulsivo en la SIP mediante la administración de diferentes moduladores del glutamato; (3) identificar nuevos biomarcadores genéticos en ratas HD.

  Con el fin de alcanzar los objetivos expuestos, se han diseñado tres conjuntos experimentales: estudio conductual, farmacológico y genético. El primero se ha propuesto para lograr el Objetivo 1 e incluye dos experimentos: el Experimento 1A que evalúa el comportamiento compulsivo en el fenotipo compulsivo de ratas, seleccionadas a través de SIP, mediante el Test de Enterramiento de Canicas (MBT, por sus siglas en ingles), el comportamiento depresivo mediante el Test de Natación Forzada (FST, por sus siglas en inglés), el comportamiento ansioso mediante la prueba del Laberinto Elevado en Cruz (EPM, por sus siglas en inglés) y la conducta de miedo mediante la Prueba de Condicionamiento del Miedo (FCT). El Experimento 1B trata sobre el procesamiento cognitivo (procesamiento de estímulos, memoria de referencia y de trabajo, y flexibilidad cognitiva) en el fenotipo compulsivo de ratas, seleccionadas a través de SIP, mediante la prueba de Reconocimiento de Objeto Novedoso (NOR, por sus siglas inglés), el Laberinto Radial de 8 Brazos (RAM, por sus siglas inglés), el laberinto acuático de Morris (MWM, por sus siglas inglés) y el MWM en condiciones inversas. El segundo conjunto experimental se ha diseñado para alcanzar el Objetivo 2: explorar el potencial terapéutico de diferentes moduladores del glutamato en la reducción del comportamiento compulsivo. Con este propósito, se evaluaron los efectos sobre la SIP de la administración aguda de N-Acetilcisteína (NAC), un inhibidor de la liberación presináptica de glutamato; memantina (MEM), un antagonista no competitivo del receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA); y lamotrigina (LAM), un inhibidor de la liberación de aminoácidos excitatorios como el glutamato. Por último, el tercer conjunto experimental se propuso para cumplimentar el Objetivo 3. El Experimento 3 analiza la expresión de genes serotonérgicos, glutamatérgicos y relacionados con la neuroplasticidad en ratas HD compulsivas en comparación conratas LD no compulsivas, seleccionadas mediante SIP. Se analizó la expresión de los genes Htr2a y Htr2c; Grin1, Grin2a, Grin2b, Grin2c y Grm2; y Bdnf en la corteza frontal (FC, por sus siglas en inglés), el hipocampo (HIP, por sus siglas en inglés) y la amígdala (AMY, por sus siglas en inglés) en ratas HD y LD mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR, por sus siglas en inglés).

  Los resultados del primer conjunto experimental muestran que, en el Experimento 1A, las ratas HD presentaron un aumento del comportamiento compulsivo, al encontrarse un mayor número de canicas parcialmente enterradas en el MBT, y una mayor resistencia a la extinción, relacionada con un mayor porcentaje de inmovilidad durante el día de supersión del estímulo incondicionado (extinción) del FCT. En comparación con las ratas LD, las ratas HD no mostraron diferencias en el comportamiento ansioso en el EPM, ni en el comportamiento depresivo en el FST. Tampoco lo hicieron en el Experimento 1B en el procesamiento de estímulos en el NOR, pero sí presentaron un déficit en la memoria de referencia y de trabajo, medido mediante un mayor número de errores cometidos en el RAM. Además, aunque las ratas HD no mostraron ningún deterioro en el aprendizaje en el MWM, sí mostraron inflexibilidad cognitiva, cuantificada por una mayor latencia para llegar a la plataforma durante el reversal MWM, en comparación con las ratas LD. En el segundo conjunto experimental, las administraciones agudas de MEM y LAM redujeron el consumo compulsivo de agua durante la SIP de forma dosis dependiente en las ratas HD, sin ningún efecto en las ratas LD. Además, con la dosis más alta de LAM, las diferencias entre ambas poblaciones desaparecen. La administración de NAC no produjo ningún efecto significativo en la SIP en ninguna de las poblaciones de ratas. Por último, en el tercer conjunto experimental las ratas HD presentaron una regulación a la baja de la expresión de los genes Htr2a, Grin1 y Bdnf en el FC en comparación con las ratas LD. Se observó una correlación negativa significativa entre la ingesta de agua y la expresión de los genes Htr2a, Grin1 y Bdnf en la FC. No se encontraron diferencias en los otros genes analizados (Htr2c, Grin2a, Grin2b, Grin2c, Grm2) entre las ratas HD y LD. Tampoco se hallaron diferencias en el HIP y la AMY a partir de los genes analizados entre las ratas HD y LD seleccionadas mediante SIP.

  En resumen, los resultados de la presente Tesis Doctoral han caracterizado a las ratas HD compulsivas seleccionadas a través SIP a nivel conductual, psicofarmacológico y genético. En la caracterización conductual, se han encontrado otras formas de comportamiento compulsivo, resistencia a la extinción de la memoria, déficits de memoria e inflexibilidad cognitiva en comparación con las ratas LD. Este perfil cognitivo podría contribuir al desarrollo y mantenimiento de la compulsividad. En cuanto a la caracterización psicofarmacológica, la implicación de la señal glutamatérgica en la modulación de la compulsividad en las ratas HD en SIP se ha evidenciado por la reducción en la ingesta de agua tras la administración de MEM y LAM, a pesar de no observarse diferencias significativas tras la administración de NAC. Por otro lado, la caracterización genética ha puesto de manifiesto que las ratas HD presentan una expresión regulada a la baja de genes serotonérgicos, glutamatérgicos y relacionados con la neuroplasticidad en el FC. Esto sugiere que los genes Htr2a, Grin1 y Bdnf podrían constituir biomarcadores de vulnerabilidad para el desarrollo de compulsividad. En conclusión, la presente tesis ha caracterizado el fenotipo compulsivo de las ratas HD a trevés de conductas alteradas y procesos cognitivos ligados a trastornos comórbidos con TOC, así como de genes regulados a la baja en el FC. Además, los datos de la misma sugirieren un posible papel terapéutico de los moduladores del glutamato en la compulsividad. Estos resultados podrían ayudar a caracterizar mejor el fenotipo compulsivo, para mejorar la detección y el tratamiento de los OCRD.

• English

  Compulsivity is characterized by persistent, inflexible, and excessive behaviors that either are aimed at avoiding perceived adverse consequences or are dependent on rigid rules, and it is a key factor in the loss of control over behavior. The cardinal symptom of obsessive-compulsive disorder (OCD), which affects 2–3 % of the population, is compulsive behavior, considered a chronic and disabling condition. Moreover, compulsive behavior is observed in several neuropsychiatric disorders such as anxiety, depression, specific phobias and schizophrenia. Therefore, compulsivity has been considered a transdiagnostic trait that should be studied according to a dimensional approach. This is in line with the U.S. National Institute of Mental Health (NIMH) Research Domain Criteria (RDoC) and the Roadmap for Mental Health Research in Europe (ROAMER), leading to a reclassification by the DSM-5 (American Psychiatric Association, 2013) and ICD-11 (“WHO | World Health Organization,” 2018), which now categorizes OCD as the central disorder in a group of related disorders called Obsessive-Compulsive and Related Disorders (OCRDs). Further investigation is required to understand the neurobehavioral alterations related to compulsivity, and their implications in different disorders.

  Compulsivity is not a unitary phenomenon, but the heterogeneity of compulsive symptoms makes treatment efficacy highly variable. Up to 40 % of patients do not respond successfully to classical psychopharmacological treatments, which are mainly based on selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs). However, clinical evidence shows that targeting glutamate mechanisms by psychopharmacotherapy may be of benefit in impaired inhibitory control. Furthermore, clinical evidence by a meta-analysis of genetic association studies, pointed towards the serotonin Htr2a and glutamate Grm2 receptors genetic polymorphism expression in OCD vulnerability. Therefore, the combination of the serotonin 5-HT2A receptor and glutamate mGlu2 receptor might be a possible target to modulate compulsivity in OCDRs. The present doctoral thesis investigates the neurobehavioral basis of compulsivity through a compulsive phenotype of rats selected by Schedule-Induced Polydipsia (SIP).

  SIP induces excessive and persistent drinking behavior in rats through intermittent foodreinforcement schedules over 20 sessions, and allows the selection of high compulsive drinkers (HD) and low non-compulsive drinkers (LD) based on their acquisition. The main objectives of the doctoral thesis are: (1) to characterize the compulsive phenotype selected by means of SIP, by identifying comorbid disorders and cognitive constructs in HD rats; (2) to modulate compulsive behavior on SIP by administrating different glutamate-modulators; and (3) to identify new genetic biomarkers in HD rats compared to LD rats.

  In order to achieve the objectives exposed, three experimental sets have been designed: behavioral, pharmacological, and genetic studies. The first one was proposed to test Objective 1 and includes two experiments: Experiment 1A assessed the compulsivelike behavior by means of the Marble Burying Test (MBT), depressive-like behavior by means of the Forced Swimming Test (FST), anxious-like behavior by means of the Elevated Plus Maze (EPM), and fear behavior by means of the Fear Condition Test (FCT) in the compulsive phenotype of rats selected by means of the SIP. Experiment 1B investigated the cognitive processing (stimuli processing; reference and working memory; and cognitive flexibility) by means of the Novel Object Recognition Test (NOR), Radial Arm Maze (RAM) and Morris Water Maze (MWM) and reversal MWM in the compulsive phenotype of rats selected by means of SIP. The second experimental set was designed to test Objective 2, exploring the therapeutic potential of different glutamate-modulators in reducing compulsive behavior. For this purpose, the effects of acute administration of N-Acetylcysteine (NAC), an inhibitor of the presynaptic glutamate release; memantine (MEM), an uncompetitive N-Methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist; and lamotrigine (LAM), an inhibitor of the excitatory amino acids release such as glutamate;

  were assessed on compulsive drinking on SIP. Finally, the third experimental set was proposed to assess Objective 3. Experiment 3 analyzed the expression of serotonergic, glutamatergic and neuroplasticity-related genes in compulsive HD compared non-compulsive LD rats selected by means of SIP. It was analyzed the expression of Htr2a and Htr2c; Grin1, Grin2a, Grin2b, Grin2c and Grm2; and Bdnf genes in frontal cortex (FC), hippocampus (HIP) and amygdala (AMY) in HD and LD rats by means of quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR).

  The results from the first experimental set revealed that, in Experiment 1A, HD rats presented increased compulsive-like behavior, since a higher number of marbles were partially buried on MBT, and resistance to memory extinction, as an increased percentage of freezing was shown during the retrieval day of FCT. However, HD rats did not differ from LD rats in anxious-like behavior on EPM, nor in depressive-like behavior on FST.

  They did not either in Experiment 1B, when stimuli processing was assessed on NOR, but did present a reference and working memory deficit (a higher number of errors committed in RAM). Even though HD rats did not exhibit any learning impairment on MWM acquisition, HD rats showed cognitive inflexibility, as demonstrated by a higher latency to reach the platform in the reversal MWM compared to LD rats. In the second experimental set, the systemic administration of MEM and LAM reduced, in a dose-dependent manner, compulsive drinking in HD rats on SIP, without any effect in LD rats. With administration of the highest dose of LAM, the differences between both populations disappeared. The administration of NAC did not produce any significant effect on any of the populations. Finally, the third experimental set revealed that HD rats presented a downregulation of Htr2a, Grin1 and Bdnf gene expressions in the FC, when compared to LD rats. Also, a significant negative correlation was observed between the amount of water intake and the expression of Htr2a, Grin1 and Bdnf genes in the FC. No differences were found in the other genes analyzed (Htr2c, Grin2a, Grin2b, Grin2c, Grm2) between HD and LD rats. Neither there were differences in HIP and AMY, regarding the assessed genes, between the HD and LD rats.

  In summary, the results have allowed us to characterize compulsive HD rats, as selected by means of SIP, at different leves: behavioral, psychopharmachological and genetic. Concerning the behavioral characterization, HD rats presented other forms of compulsive behavior, resistance to memory extinction, memory impairments and cognitive inflexibility if we compare to LD rats. This behavioral profile could be modulating the development and maintenance of compulsivity. Regarding the psychopharmachological characterization, the implication of the glutamatergic signal in the modulation of HD rats’ compulsive behavior in SIP have been proved by a dose-dependent reduction in the water intake after the administration of MEM and LAM. No significant effects were found after the administration of NAC. On the other hand, the genetic characterization evidenced that HD rats presented a downregulated expression of serotonergic, glutamatergic and neuroplasticity-related genes in the FC, suggesting that Htr2a, Grin1 and Bdnf genes could constitute vulnerability biomarkers of compulsivity. In conclusion, the present thesis characterized the compulsive phenotype of HD rats through neurobehavioral impairments regarding comorbid disorders with OCD, as well as throuh downregulated genes in FC.

  Moreover, data pointed to a potential therapeutic role of glutamate-modulators in compulsivity. These results might help to better characterize the compulsive phenotype to improve the detection and treatment of OCRDs.