Resumen de Producción de anticuerpos y generación de metodologías inmunoquímicas para la detección de biotoxinas
La patulina es un metabolito secundario tóxico producido por diferentes hongos pertenecientes a los géneros Aspergillus, Paecilomyces, Penicillium y Xylaria. Su presencia en la cadena alimentaria se debe a la contaminación de una gran variedad de alimentos con hongos productores, entre los cuales P. expansum, que infecta fundamentalmente manzanas, es considerado el principal hongo productor de patulina. A raíz de su reactividad con compuestos nucleofílicos a nivel celular y sus efectos tóxicos agudos reportados en riñones, intestino y el sistema inmunitario de vertebrados, la patulina se encuentra en la corta lista de micotoxinas vigiladas y reguladas mundialmente. Los límites máximos para patulina establecidos por la UE son 50 µg/kg para zumos, 25 µg/kg para productos sólidos y 10 µg/kg para alimentos destinados al consumo infantil. De modo similar a otros contaminantes relevantes, son muchos los procedimientos analíticos desarrollados para la detección de patulina en alimentos. No obstante, dichas metodologías se basan principalmente en técnicas cromatográficas, no existiendo métodos inmunoanalíticos que permitan su determinación fiable.
El enfoque principal de esta tesis doctoral se ha basado en la síntesis de nuevos derivados funcionalizados de patulina y su aplicación para el desarrollo de inmunoensayos que permitan detectar la micotoxina de modo cuantitativo en diferentes matrices alimentarias.
En una primera aproximación, los análogos estructurales, denominados haptenos, fueron sintetizados introduciendo un brazo espaciador que permitiera su acoplamiento posterior a proteínas portadoras, manteniendo lo más intacto posible el esqueleto original de la toxina. Con este propósito, se prepararon tres haptenos convencionales, los cuales fueron finalmente empleados para la preparación de bioconjugados tras su caracterización mediante técnicas espectroscópicas. Empleando estrategias previamente descritas en la bibliografía, se sintetizaron los haptenos C4 y C7, mientras que el hapteno C6 se obtuvo mediante una aproximación novedosa. Una vez preparados y caracterizados los conjugados, se llevó a cabo evaluación de la respuesta inmunitaria generada por cada hapteno mediante la inmunización de conejos.
Ante la ausencia de una adecuada respuesta inmunitaria y por tanto de anticuerpos con suficiente afinidad hacia la patulina, se decidió evaluar la viabilidad de un método de derivatización de la micotoxina que permitiera producir anticuerpos frente a un derivado estable. Para ello, se desarrollaron dos estrategias de derivatización aprovechando la reactividad de patulina con grupos nucleofílicos. El uso de diferentes compuestos aromáticos monotiolados como reactivos para la derivatización permitió obtener seis aductos, y la funcionalidad de esta aproximación se estimó mediante la inmunización con el conjugado BSA–V y su análogo, el conjugado BSA–V4. La obtención de anticuerpos anti–V impulsó el desarrollo del segundo método de derivatización, el cual estuvo basado en la formación de derivados de patulina empleando compuestos aril-1,2-ditiol. Como resultado, se produjeron y caracterizaron un total de 5 aductos, empleando finalmente derivados proteicos de los aductos VII, VIII y XI para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales. Los haptenos VIIa, VIIIa, XIa y XIb permitieron la obtención de un grupo amplio de anticuerpos, los cuales fueron exhaustivamente caracterizados y empleados exitosamente para el desarrollo de inmunoensayos enzimáticos (ELISA) y de tiras inmunocromatográficas. Por último, la aplicación de ambas técnicas a muestras reales permitió demostrar su utilidad para el análisis de patulina a niveles legislativamente relevantes. En definitiva, esta tesis doctoral ha permitido el desarrollo de los primeros métodos rápidos basados en anticuerpos para la determinación de patulina, la única micotoxina regulada para la que no existían aproximaciones analíticas de este tipo.
