Resumen de Immunogenomic characterization of hcc and etiology-dependent response to immunotherapies
Título Caracterización inmunogenómica del CHC y respuesta a inmunoterapias según etiología.
Introducción El cáncer de hígado es una enfermedad devastadora y representa el sexto cáncer más común en todo el mundo y la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer a nivel mundial[1]. El carcinoma hepatocelular (CHC) representa el 90% de todos los casos de cáncer primario de hígado. Se estima que alrededor del 50-60 % de los pacientes con CHC estarán expuestos a tratamientos sistémicos a lo largo de su vida, especialmente en estadios avanzados de la enfermedad[2]. La comprensión completa de la diversidad del CHC para desarrollar terapias dirigidas requerirá desentrañar los eventos moleculares que subyacen al proceso[3]. En este sentido, el perfil molecular del CHC, con análisis de genoma completo, metilación de ADN y análisis de perfiles de expresión de ARN mensajero, ha contribuido significativamente a la comprensión de la patogénesis molecular de esta enfermedad. En los últimos años, la clasificación inmunológica del CHC ha permitido identificar los tumores de la clase inmune[4], un subtipo de tumores con una prevalencia del 25% caracterizado por una alta infiltración inmunológica y características moleculares que se asemejan a los pacientes con melanoma que responden a las terapias inmunes. Sin embargo, los rasgos inmunológicos del 75% restante de los pacientes que no pertenecían a esta clase inmune, estaban mal caracterizados.
Por otro lado, hasta el momento, ningún estudio había demostrado que la etiología fuera relevante a la hora de decidir la mejor opción de tratamiento para el paciente con CHC. Sin embargo, la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), tiene una prevalencia poblacional de ~25% globalmente[5]. Su manifestación más severa, la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), tiene una prevalencia variable entre el 5- 20% globalmente y constituye un serio problema de salud pública[6,7]. Su incidencia está aumentando juntamente con el aumento de la obesidad/diabetes/síndrome metabólico. El riesgo inherente de progresión a cirrosis y CHC ha sido extensamente demostrado[6,8]. El CHC que se desarrolla como consecuencia de la EHNA tiene características moleculares e inmunitarias únicas en comparación con otras etiologías.
Además, las comorbilidades asociadas con EHNA pueden impedir la implementación de terapias potencialmente curativas en una mayor proporción de pacientes en comparación con CHC relacionado con otras etiologías[6].
Actualmente, el manejo de los pacientes con CHC y la asignación de estos a las distintas opciones terapéuticas, se basa en la clasificación BCLC (Barcelona Clinic Liver Cancer), propuesta en 1998, que se revisa y actualiza regularmente[9–11], e incluye variables pronósticas relacionadas con el estado del tumor, la función hepática y el estado funcional de la salud, junto con variables dependientes del tratamiento obtenidas de estudios de cohortes y ensayos aleatorizados[12]. Los únicos tratamientos que han demostrado ser efectivos en pacientes en estadios avanzados son las terapias moleculares tipo TKI (inhibidores de la tirosina-quinasa, sorafenib y análogos) o basadas en inmunoterapia (inhibidores de punto de control inmunitario tipo anti-PD1 y análogos)[2,13]. En la actualidad, la combinación de atezolizumab/bevacizumab se ha convertido en el nuevo estándar de atención en primera línea, ya que fue el primer régimen que mejoró la supervivencia global en comparación con sorafenib[14]. Esta terapia combinada mostró la tasa más alta de respuesta objetiva (~30%) en comparación con todas las demás terapias disponibles para el CHC. Aún así, ~70% de pacientes presentan estabilidad o progresión a las terapias actualmente disponibles.
Existe, por tanto, una necesidad crítica de identificar los mecanismos que predisponen a los pacientes a presentar resistencia a las inmunoterapias, incluyendo la etiología del CHC, las estrategias terapéuticas, incluyendo estratificación de pacientes, para superar dicha resistencia y encontrar biomarcadores que puedan predecir la respuesta/resistencia a las inmunoterapias.
Hipótesis Las hipótesis de esta tesis son las siguientes: - La comprensión de las características inmuno-moleculares y genómicas de los CHCs contribuirá a desarrollar nuevos y mejores estrategias terapéuticas y potencialmente conducirá descubrimiento de biomarcadores efectivos de respuesta a las terapias inmunológicas.
- El estudio de los mecanismos de respuesta a inmunoterapias específicamente en tumores de etiología EHNA permitirá diseñar estrategias específicas de tratamiento en estos pacientes.
Objetivos Teniendo en cuenta lo expuesto anteriormente, los objetivos específicos de esta tesis doctoral son los siguientes: - Establecer una clasificación inmunogenómica de CHC, mediante la integración de características del microambiente tumoral y rasgos moleculares del tumor, capaz de identificar diferentes mecanismos que gobiernan la respuesta inmune y mecanismos de exclusión inmune y desertificación.
- Evaluar específicamente los efectos de las inmunoterapias en el factor de riesgo emergente de CHC, EHNA, que podría ser determinante para la toma de decisiones clínicas en esta patología.
Métodos Estudio #1 (Montironi et al., Gut 2022) El estudio se realizó en una cohorte compuesta por 240 pacientes balanceados respecto a las etiologías que con más frecuencia desencadenan CHC, con muestras tanto de CHC como de tejido no tumoral adyacente. La información clínica fue recopilada y analizada para cada uno de los pacientes en el estudio.
Se realizó un análisis histopatológico que incluyó la valoración de los infiltrados inmunes, la presencia de estructuras linfoides terciarias y la presencia de linfocitos intratumorales y estromales en el tumor. Además, se realizó el inmunofenotipado de las muestras mediante inmunohistoquímica de PD1, PDL1, CD8, LAG3, CTLA4, TIGIT y TIM3, así como también el estudio mediante fluorescencia multiplex en un subgrupo de pacientes de los marcadores CD8, PD1 y PDL1.
Los análisis genómicos y moleculares de las muestras se efectuaron mediante secuenciación de ARN, y del exoma completo. Todo ello permitió la identificación de subtipos moleculares de CHC, la, determinación de las proporciones de células inmunes en las muestras utilizando herramientas como CIBERSORTx[15] y xCell[16], determinación de la carga mutacional y de inserciones y deleciones (indels) totales, así como también la predicción de neoantígenos, determinación de aberraciones cromosómicas mediante herramientas como CNApp[17] o GISTIC[18]. Además, se realizó la secuenciación del receptor de células T (TCR) en un subgrupo de pacientes lo que permitió conocer el repertorio de células T en nuestras muestras. Para generar la firma “inflamed” hemos utilizado el factor inmune cuya obtención he ha sido explicada previamente[4]. Posteriormente, se seleccionaron aquellos 17 primeros genes diferencialmente expresados entre la clase inmune y la no inmune y se incorporaron adicionalmente a la firma tres genes CXCL9, GZMB and CXCR4[19–21] basándonos en su rol significativo en la inflamación asociada al cáncer. Esta firma compuesta finalmente por 20 genes ha permitido identificar de forma fidedigna la clase inflamada; además ha sido validada en 3 cohortes adicionales que incluyen en total 660 pacientes. La tercera cohorte de validación contenía muestras de sangre periférica de 68 pacientes. Las muestras de sangre se centrifugaron y el plasma se recuperó y se procesó con el panel de ensayo Olink de inmunooncología e inflamación (Olink, Suecia), que es un inmunoensayo multiplex de alto rendimiento que permite el análisis de 92 biomarcadores de proteínas. Para el análisis de biomarcadores basados en biopsia líquida, primero realizamos una regresión logística binomial univariada y todas aquellas proteínas con una p<0,05 se ingresaron en un modelo de regresión logística binomial multivariada. Esto nos permitió diseñar una firma de 13 proteínas con un buen desempeño en la captura de la clase Inflamada.
Estudio #2 (Pfister el al., Nature 2021) En este estudio se han utilizado diferentes modelos preclínicos de CHC sobre EHNA. Se han utilizado ratones C57BL/6J que han sido alimentados con dieta estándar, normal (agua y comida ad libitum) mientras que otros han sido alimentados con una dieta rica en grasas y deficiente en colina (CD-HFD), o una dieta rica en grasas trans (WD-HTF) por 6 o 12-13 meses. Para estudios de intervención los ratones macho alimentados con CD-HFD fueron tratados mediante inyección intravenosa en la vena lateral de la cola, con 25ug de anticuerpo anti-CD8, 50ug de anticuerpo anti-NK1.1, 300ug de anti- PDL1, 200ug anti-TNF, 100ug anti-PD1, dos veces por semana durante 8 semanas.
Para evaluar la supervivencia en ratones tratados con inmunoterapia, ratones transgénicos NrasG12Vp19Arf-/- fueron tratados con anticuerpo anti-PD1 con una dosis inicial intraperitoneal de 500ug seguida por dosis de bisemanales de 200ug por 8 semanas mientras que los ratones transgénicos MYC-lucOS sg-p53-/- - OVA, SIY, SIN se trataron con una dosis intraperitoneal de 200ug de anti-PD1 o inmunoglobulina (Ig, control). La línea celular de CHC p53/Hras mutante procedente de ratones C57BL/6J, RIL-175 Hra/p53 ha sido tratada tal y como se ha descrito en otra publicación[22]. Por último, se utilizaron tejidos de ratones knock-in inducibles que expresan el complejo alternativo RPB5 (URI) de la prefoldina en hepatocitos (hURI-tetOFFhep), ratones Pdcd1-/- y ratones no transgénicos como control. La monitorización del desarrollo de tumores en los distintos modelos preclínicos utilizados se realizó por medio de resonancia magnética. Los linfocitos fueron aislados y marcados para ser analizados por citometría de flujo. Se realizó secuenciación de ARN de células individuales en muestras de ratón efectuando además estudios de velocidad del RNA explorando la abundancia del RNA mensajero naciente, precursor (unspliced) y maduro (spliced) para conocer la dinámica (velocidad y dirección de cambio) de los transcritos de interés. La espectrometría de masas también se utilizó para aislar distintas poblaciones de células T y las citoquinas y quimioquinas fueron caracterizadas con un ELISA multiplexado. Finalmente, se realizó análisis histopatológico de las muestras con tinciones inmunohistoquímicas así como inmunofluorescencia e hibridación in situ para PDL1, TNF y CXCR6.
En este estudio también se caracterizaron muestras humanas. Concretamente, se realizó a) citometría de flujo tanto en biopsias como en piezas de resección quirúrgica; b) secuenciación de RNA de alto rendimiento de muestras congeladas de 206 pacientes (EHGNA n=51; EHNA con fibrosis F0 n=34, F1 n=53, F2 n=54 y F4 n=14); c) tinciones inmunohistoquímicas para CD4, CD8, y PD1 (n=65). CD4 y PD1 fueron analizados en muestras hepáticas de 4 pacientes sanos, 16 pacientes con EHNA y tejido hepático adyacente a tumor procedente de distintas etiologías (EHNA n=26, Hepatitis C n=19, Hepatitis B n=3, alcohol n=5, otras n=2).
Además, se realizó un meta-análisis para evaluar el beneficio global en términos de supervivencia de los inhibidores de punto de control inmunitario tipo anti-PD1 comparado con sorafenib (el tratamiento de referencia en CHC entre 2008 y 2018) incluyendo 3 estudios aleatorios fase 3 con más de 1600 pacientes con CHC avanzado (CheckMate-459[23], IMbrave150[24] y KEYNOTE-240[25]).
Finalmente, los pacientes con CHC derivado de EHNA tratados con inmunoterapia demostraron una menor supervivencia global comparado con otras etiologías, en otras dos cohortes adicionales (n=65, nivolumab n=31, y pembrolizumab n=34[26] y n=427[27,28]).
Resultados - Estudio #1 (Montironi et al., Gut 2022) a. Se identificó una subclase nueva de CHC, La clase inflamada con una prevalencia del 37% que incluye tumores de la subclase inmune descrita anteriormente (22%) así como la subclase “immune-like” (15%) de características similares a la clase inmune. La clase inflamada mostró una marcada señalización por interferón, actividad citolítica y citoquinas efectoras inmunitarias. En general, la clase inflamada presentó una mayor infiltración y una composición inmunitaria antitumoral más favorable con un repertorio de células T más diverso y un enriquecimiento de firmas que predicen la respuesta a la inmunoterapia. Se identificó una firma genética compuesta por 20 genes (la firma “inflamed”), para la identificación de los tumores de la clase inflamada y se validó en tres cohortes adicionales (n=660 pacientes). En todas las cohortes, la firma “Inflamed” presentó un AUC de 0.91, una precisión del 85% y una sensibilidad de 92%.
b. Hemos diseñado una firma de 13 proteínas con una buena eficacia en la captura de la clase Inflamada (AUC 0.91, precisión 85%, sensibilidad 92%). La mayoría de estas proteínas se sobreexpresaron en sangre periférica de tumores inflamados e incluyeron proteínas implicadas en la activación inmunitaria (IL18, PDL1), citólisis (GZMA, GZMH), superfamilia TNF (TNFRSF21, TWEAK) o angiogénesis (TIE2, PGF, VEGFR2).
c. Los tumores no inflamados fueron clasificados en dos subclases: la subclase intermedia y la excluida. La subclase intermedia se caracterizó por un enriquecimiento en mutaciones de TP53 y pérdidas cromosómicas en genes relacionados con el sistema inmunitario (es decir, CXCL9-10, IRF2 y CIITA). La subclase excluida estaba enriquecida en mutaciones CTNNB1, lo que condujo a una alta activación de la vía Wnt/ßcatenina.
d. Las mutaciones en CTNNB1 con alta o moderada activación de la vía Wnt/ßcatenina en la subclase intermedia fueron menos prevalentes que en la subclase excluida (88% vs 27%, p=5.23x10-4). Por otro lado, si bien la mayoría de las mutaciones en CTNNB1 observadas en la clase inflamada producían una activación leve, el 93% de las mutaciones detectadas en la subclase immune-like provocaban una activación marcada (moderada o alta) de la vía Wnt/ßcatenina, que no era diferente a la observada en la subclase excluida (93% vs 88%, p>0.05).
e. En nuestra cohorte, hemos observado que dos tercios de los tumores que presentan marcada activación de la vía Wnt/ßcatenina se caracterizan por un infiltrado inmune escaso o ausente, mientras que, en el tercio restante, esta marcada activación de la vía se compensaba por mecanismos de inflamación e infiltración inmune.
- Estudio #2 (Pfister el al., Nature 2021) a. Los modelos preclínicos de ratón presentaron características moleculares similares al EHNA humano con reproducción histológica de todas las lesiones observadas en una biopsia en humanos. La gravedad de la EHNA se correlacionó con la abundancia de células T CD8+ con marcadores de agotamiento (por ejemplo, Eomes, Pdcd1, Ki67low) y de activación (con expresión de CD69+CD44+ y niveles elevados de ARNm de Gzmb, Ifng y Tnf).
b. Dado el elevado número de células T identificadas en estos modelos EHNA, exploramos el perfil terapéutico de la inmunoterapia. El 30% de los ratones C57BL/6 alimentados con una dieta CD-HFD por 13 meses desarrollaron tumores. Estos ratones con CHC se trataron con anti-PD1 o control por dos meses. Observamos que la inmunoterapia no redujo el volumen tumoral en ninguno de estos ratones. Por el contrario, observamos un aumento en la fibrosis sin cambios en cuanto al daño hepático. En estos ratones tratados con anti-PD1 también se observó un incremento en el número de células T CD8+PD1+ con alta expresión de ARNm de Cxcr6 o Tnf.
Tampoco se observó regresión de los tumores con terapia anti-PDL1.
c. Las células T CD8+PD1+ inducen la transición a CHC en los ratones con EHNA en lugar de realizar una vigilancia inmunológica efectiva. El agotamiento de las células T CD8+ en ratones con EHNA (alimentados con una dieta CD-HFD por 10 meses) disminuyó el daño hepático y la incidencia de CHC. Obtuvimos los mismos resultados luego del agotamiento conjunto de CD8+ y NK1.1+.
d. Explorando un perfil preventivo en ratones EHNA (tratados 12 meses con CDHFD), hemos observado que la inmunoterapia anti-PD1 (administrada por 8 semanas) agravó el daño hepático con mayor incidencia de CHC de forma dependiente de células CD8+. Por otro lado, en este mismo contexto, el tratamiento con anti-CD8 y anti-TNF mejoraron el daño hepático y disminuyeron la incidencia de tumores. Aquellos ratones con depleción de PD1 (Pcdc1-/-) mostraron una mayor y más temprana incidencia de CHC junto a un mayor número de células T CD8+ activadas.
e. Este tratamiento preventivo con anti-PD1 se asoció con un perfil protumorigénico inmunosupresor descrito previamente[29], que captura rasgos de agotamiento de células T, vías de señalización pro-carcinogénicas y mediadores de inhibición y tolerancia inmune. Este perfil inmunosupresor fue parcialmente revertido en ratones con depleción de células T CD8+.
f. Las células T CD8+PD1+ de los ratones con EHNA, mostraron niveles reducidos de FOXO1, lo cual indica un fenotipo de célula T residente en tejido, potencialmente combinado con una función efectora (que se correlaciona con niveles elevados de calcio en estas células T CD8+PD1+). Esta disminución de la expresión de FOXO1 se correlacionó con el aumento en la expresión de CXCR6+, PD1+, Gzmb y CD69+.
g. En las dos cohortes de pacientes con EHNA (n=17 y n=11), se identificó un incremento de células T CD8+PD1+ con un fenotipo residente. Estas células presentaron una firma de expresión similar a la observada en ratones con EHNA (por ejemplo, PDCD1, GZMB, TOX, CXCR6, RGS1, SELL). Además, el número de células T PD1+ intratumorales en pacientes con CHC-EHNA tratados con anti-PD1 fue mayor que en pacientes con CHC y etiología viral (específicamente hepatitis C - HCV).
h. Mediante un meta-análisis que incluyó tres ensayos clínicos randomizados en fase III (CheckMate-459[30], KEYNOTE-240[31], e Imbrave150[14]) con un número total de 1656 pacientes analizados, se demostró que, a pesar de que la inmunoterapia ha mejorado la supervivencia en la población global (Hazard Ratio (HR)=0.77; 95% intervalo de confianza (CI) 0.63–0.94), la supervivencia fue superior al brazo control en pacientes con CHC-virus de la Hepatitis B (HBV) (n= 574; p= 0.0008), CHC-HCV (n= 345; p= 0.04), pero no en pacientes con CHC-no-viral (n= 737; p= 0.39).
i. La magnitud de los efectos de las inmunoterapias fue menor en etiologías novirales que en virales. Este hallazgo puede sentar las bases para la estratificación de los pacientes según la etiología para futuros ensayos clínicos.
j. En una cohorte adicional de 130 pacientes (EHGNA n=13; Otros n=117), el tratamiento con inmunoterapia en pacientes EHGNA se vio asociado a una menor supervivencia global (5.4 meses; 95% CI 1.8-9.0 meses, vs. 11 meses 95% CI 7.5- 14.5; p=0.023). EHGNA se constituyó como un factor independiente predictor de menor sobrevida en pacientes con CHC tratados con inmunoterapia. Estos hallazgos también se validaron en una cohorte adicional con 118 pacientes CHC tratados con inmunoterapia (EHGNA n=11; Otros n=107), con resultados semejantes.
Conclusiones. - El primer estudio proporciona una amplia caracterización de los distintos perfiles inmunogenómicos del CHC, clasificándolos, a grandes rasgos en tumores inflamados (~35%) y no inflamados (~65%).
- La clase Inflamada muestra una mayor infiltración y una composición inmune antitumoral más favorable (células CD8+, repertorio de células T más rico y diverso y macrófagos M1).
- La firma Inflamed identifica de manera fiable a los pacientes dentro de la subclase Inflamado de CHC y se valida en tres cohortes adicionales (que comprenden 660 pacientes).
- La firma desarrollada a partir de proteínas presentes en sangre periférica representa la prueba inicial de que la clase inflamada puede identificarse mediante el uso de biomarcadores en sangre periférica, aunque en el futuro se requerirá una mayor validación en cohortes prospectivas adicionales.
- La subclase intermedia está enriquecida en mutaciones de TP53 y tiene mayor número de pérdidas cromosómicas que afectan genes relacionados con el sistema inmunitario, mientras que la subclase excluida presenta mayor número de mutaciones en CTNNB1, con una alta activación de la vía Wnt/ßcatenina.
- La presencia de un subconjunto de tumores con mutaciones en CTNNB1 y marcada activación de la vía de señalización de Wnt/ßcatenina fuera de la subclase excluida con características de inflamación, sugiere que el microambiente tumoral puede remodelarse hacia un perfil inflamado a pesar de la activación de Wnt/ßcatenina.
- Tanto en pacientes como en ratones con etiología EHNA, se ha observado un incremento de células T CD8+ con marcadores de agotamiento (por ejemplo, Eomes, Pdcd1, Ki67low) y de activación (con expresión de CD69+CD44+ y niveles elevados de ARNm de Gzmb, Ifng y Tnf). Estos marcadores se correlacionaban con la severidad de la EHNA.
- La inmunoterapia que se ha suministrado de forma terapéutica para producir regresión tumoral en modelos murinos de CHC, ha demostrado menor efectividad en modelos EHNA que en modelos no-EHNA.
- El análisis de diversas cohortes humanas de pacientes tratados con inmunoterapias ha demostrado que EHNA es un predictor pronóstico desfavorable.
- Los resultados de un meta-análisis incluyendo más de 1600 pacientes han demostrado que los tumores CHC de etiología no viral presentan menor respuesta que los de etiología no-viral a los inhibidores del punto de control inmunitario.
- Finalmente, estos resultados proporcionan una visión mecanicista integral y una base racional para la estratificación de pacientes con CHC según su etiología de daño hepático y cáncer para el diseño de futuros ensayos de terapia personalizada contra el cáncer.
Referencias 1 Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians 2021;71:209–49. doi:10.3322/CAAC.21660 2 Llovet JM, Kelley RK, Villanueva A, et al. Hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 2021;7. doi:10.1038/s41572-020-00240-3 3 Shimada S, Mogushi K, Akiyama Y, et al. Comprehensive molecular and immunological characterization of hepatocellular carcinoma. EBioMedicine 2019;40:457–70. doi:10.1016/J.EBIOM.2018.12.058 4 Sia D, Jiao Y, Martinez-Quetglas I, et al. Identification of an Immune-specific Class of Hepatocellular Carcinoma, Based on Molecular Features. Gastroenterology 2017;153:812–26. doi:10.1053/j.gastro.2017.06.007 5 Younossi ZM. Non-alcoholic fatty liver disease – A global public health perspective. Journal of Hepatology. 2019;70:531–44. doi:10.1016/j.jhep.2018.10.033 6 Llovet JM, Willoughby CE, Singal AG, et al. Non-alcoholic steatohepatitisrelated hepatocellular carcinoma (NASH-HCC): pathogenesis and treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 2022.
7 Wong RJ, Aguilar M, Cheung R, et al. Nonalcoholic steatohepatitis is the second leading etiology of liver disease among adults awaiting liver transplantation in the United States. Gastroenterology 2015;148:547–55.
doi:10.1053/J.GASTRO.2014.11.039 8 Younossi Z, Anstee QM, Marietti M, et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 2018;15:11–20. doi:10.1038/nrgastro.2017.109 9 Reig M, Forner A, Rimola J, et al. BCLC strategy for prognosis prediction and treatment recommendation: The 2022 update. Journal of Hepatology Published Online First: 19 November 2021. doi:10.1016/J.JHEP.2021.11.018 10 Forner A, Reig ME, Rodriguez De Lope C, et al. Current strategy for staging and treatment: the BCLC update and future prospects. Semin Liver Dis 2010;30:61– 74. doi:10.1055/S-0030-1247133 11 Llovet JM, Brú C, Bruix J. Prognosis of hepatocellular carcinoma: the BCLC staging classification. Semin Liver Dis 1999;19:329–37. doi:10.1055/S-2007-1007122 12 Llovet JM, Pinyol R, Kelley RK, et al. Molecular pathogenesis and systemic therapies for hepatocellular carcinoma. Nature Cancer Reviews, in press 2022.
13 Llovet JM, Castet F, Heikenwalder M, et al. Immunotherapies for hepatocellular carcinoma. Nature Reviews Clinical Oncology 2021 19:3 2021;19:151– 72. doi:10.1038/s41571-021-00573-2 14 Finn RS, Qin S, Ikeda M, et al. Atezolizumab plus Bevacizumab in Unresectable Hepatocellular Carcinoma. New England Journal of Medicine 2020;382:1894–905. doi:10.1056/NEJMoa1915745 15 Newman AM, Steen CB, Liu CL, et al. Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry. Nature Biotechnology 2019;37:773–82. doi:10.1038/s41587-019-0114-2 16 Aran D, Hu Z, Butte AJ. xCell: Digitally portraying the tissue cellular heterogeneity landscape. Genome Biology 2017;18:1–14. doi:10.1186/S13059-017- 1349-1/FIGURES/4 17 Franch-Expósito S, Bassaganyas L, Vila-Casadesús M, et al. CNApp, a tool for the quantification of copy number alterations and integrative analysis revealing clinical implications. Elife 2020;9. doi:10.7554/ELIFE.50267 18 Mermel CH, Schumacher SE, Hill B, et al. GISTIC2.0 facilitates sensitive and confident localization of the targets of focal somatic copy-number alteration in human cancers. Genome Biology 2011;12:1–14. doi:10.1186/GB-2011-12-4-R41/FIGURES/7 19 Biasci D, Smoragiewicz M, Connell CM, et al. CXCR4 inhibition in human pancreatic and colorectal cancers induces an integrated immune response. Proc Natl Acad Sci U S A 2020;117:28960–70. doi:10.1073/PNAS.2013644117 20 Dangaj D, Bruand M, Grimm AJ, et al. Cooperation between Constitutive and Inducible Chemokines Enables T Cell Engraftment and Immune Attack in Solid Tumors.
Cancer Cell 2019;35:885-900.e10. doi:10.1016/J.CCELL.2019.05.004 21 Voskoboinik I, Whisstock JC, Trapani JA. Perforin and granzymes: function, dysfunction and human pathology. Nat Rev Immunol 2015;15:388–400.
doi:10.1038/NRI3839 22 Shigeta K, Datta M, Hato T, et al. Dual Programmed Death Receptor-1 and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Blockade Promotes Vascular Normalization and Enhances Antitumor Immune Responses in Hepatocellular Carcinoma. Hepatology 2020;71:1247–61. doi:10.1002/HEP.30889 23 Yau T, Kang Y, Kim T, et al. Efficacy and Safety of Nivolumab Plus Ipilimumab in Patients With Advanced Hepatocellular Carcinoma Previously Treated With Sorafenib: The CheckMate 040 Randomized Clinical Trial. JAMA Oncol 2020;6.
doi:10.1001/JAMAONCOL.2020.4564 24 Cheng AA-L, Qin S, Ikeda M, et al. IMbrave150: Efficacy and safety results from a ph III study evaluating atezolizumab + bevacizumab vs sorafenib as first treatment for patients with unresectable hepatocellular carcinoma. In: ESMO Congress Asia. Singapore: 2019.
25 Finn RS, Ryoo BY, Merle P, et al. Pembrolizumab As Second-Line Therapy in Patients With Advanced Hepatocellular Carcinoma in KEYNOTE-240: A Randomized, Double-Blind, Phase III Trial. J Clin Oncol 2020;38:193–202.
doi:10.1200/JCO.19.01307 26 Scheiner B, Kirstein MM, Hucke F, et al. Programmed cell death protein-1 (PD-1)-targeted immunotherapy in advanced hepatocellular carcinoma: efficacy and safety data from an international multicentre real-world cohort. Aliment Pharmacol Ther 2019;49:1323–33. doi:10.1111/APT.15245 27 Fessas P, Kaseb A, Wang Y, et al. Post-registration experience of nivolumab in advanced hepatocellular carcinoma: an international study. J Immunother Cancer 2020;8. doi:10.1136/JITC-2020-001033 28 Pinato DJ, Kaneko T, Saeed A, et al. Immunotherapy in Hepatocellular Cancer Patients with Mild to Severe Liver Dysfunction: Adjunctive Role of the ALBI Grade.
Cancers (Basel) 2020;12:1–17. doi:10.3390/CANCERS12071862 29 Moeini A, Torrecilla S, Tovar V, et al. An Immune Gene Expression Signature Associated With Development of Human Hepatocellular Carcinoma Identifies Mice That Respond to Chemopreventive Agents. Gastroenterology 2019;157.
doi:10.1053/j.gastro.2019.07.028 30 Yau T, Park JW, Finn RS, et al. CheckMate 459: A randomized, multi-center phase 3 study of nivolumab (NIVO) vs sorafenib (SOR) as first-line (1L) treatment in patients (pts) with advanced hepatocellular carcinoma (aHCC). Annals of Oncology 2019;30:874–5.
31 Finn RS, Ryoo B-Y, Merle P, et al. Results of KEYNOTE-240: phase 3 study of pembrolizumab (Pembro) vs best supportive care (BSC) for second line therapy in advanced hepatocellular carcinoma (HCC). Journal of Clinical Oncology 2019;37:4004– 4004. doi:10.1200/JCO.2019.37.15_suppl.4004
