Resumen de Especificidad de función de las subunidades catalíticas p110 alfa y p110 beta de PI3K de clase IA en la progresión del ciclo celular

Miriam Marqués Cabrero

• ÍNDICE ABREVIATURAS".7 SUMMARY"9 INTRODUCCIÓN".11 I El ciclo celular"...11 1. CDKs (cyclin dependent kinases): REGULADORES MOLECULARES DEL CICLO CELULAR"..11 2.REGULACIÓN DE LAS CDKS"...12 a)Ciclinas.

  b)Fosforilación de las CDKs.

  c)CKIs (CDK kinase inhibitor).

  d) Degradación.

  e) Localización celular.

  3.p21cip"13 a) Estructura de p21Cip1"..

  b) Función activadora de complejos ciclina D/CDK c) Papel proapoptótico de p21Cip1" d) Función en transcripción" e) p21Cip1 inhibidor de la síntesis de ADN"...

  f) p21Cip1 y respuesta al daño al ADN"..

  g) Función en diferenciación"..

  4.CONTROL DE LAS FASES G0, G1 y S DEL CICLO CELULAR"..15 a)Inicio del ciclo celular: crecimiento.

  b) Transición G0/G1.

  c) Fase S: Replicación del ADN.

  II PI3K "19 1. CLASES DE PI3K"..19 a)Clase I b) Clase II c) Clase III 2.ACTIVACIÓN E INACTIVACIÓN DE PI3K DE CLASE IA"21 3.SEÑALIZACIÓN DE PI3K DE CLASE I".. 22 a) PDK1 y PKB b) TEC quinasas c) GEFs y GAPs 5.FUNCIONES BIOLÓGICAS DE PI3K DE CLASE IA"22 a) Supervivencia.

  b) Metabolismo c) Reorganización del citoesqueleto y migración celular d) Sistema Inmune e) Ciclo celular III PI3K en ciclo celular"25 1. CRECIMIENTO"25 2. TRANSICIÓN G0/G1"25 3.TRANSICIÓN G1/S"26 4.COORDINACIÓN DE CRECIMIENTO Y DIVISIÓN".26 5.FASES G2 y M"27 IV Especificidad de función de las isoformas p110¿ y p110ß".27 1. RATONES KNOCK OUT DE p110¿ y p110ß 2. APROXIMACIONES MOLECULARES".27 a) Microinyección de anticuerpos b) ARN interferente y mutantes activos e inactivos de p110 3. NUEVOS MODELOS ANIMALES".27 OBJETIVOS".33 MATERIALES Y MÉTODOS"..37 1. CULTIVO CELULAR".37 a) Lineas celulares.

  b)Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs).

  c)Generación de líneas estables.

  2.TRANSFECCIONES E INFECCIONES"..37 3. ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR"..38 a) Tinción de ADN.

  b) Sincronización de cultivos celulares.

  c) Ensayos de DNA combing 4. ENSAYOS BIOQUÍMICOS".39 a) Lisis,fraccionamiento celular, inmunoprecipitaciones y Western Blot.

  b) Ensayos lípido kinasa.

  c) Ensayos quinasa de PKB.

  d) Anticuerpos y reactivos.

  5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Y PROGRAMAS INFORMÁTICOS"42 RESULTADOS"45 I Consecuencias de interferir con la expresión y actividad de p110¿ y p110ß"45 1. ENSAYOS CON MUTANTES ACTIVOS p110¿CAAX Y p110ßCAAX"45 2. ENSAYOS CON MUTANTES INACTIVOS K802R-p110¿ y K805R-p110ß "46 3. TRANSFECCIÓN DE ARNs DE PEQUEÑO TAMAÑO EN FIBROBLASTOS MURINOS "48 4.ESTUDIOS CON shARNs INDUCIBLES EN LINEAS CELULARES DE OSTEOSARCOMA HUMANO (U2OS)"49 5. ENSAYOS CON FIBROBLASTOS EMBRIONARIOS MURINOS (MEFs) "50 II Función de las isoformas p110¿ y p110ß en la señalización temprana de ciclo celular"..51 1.PKB"51 2. p70S6K"52 3. FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN FOXO"53 III Función de las isoformas p110¿ y p110ß en la expresión de ciclinas de G1/S "54 IV Función de las isoformas p110¿ y p110ß en transición G1/S "58 1. REGULACIÓN DE LOS NIVELES DE c-Myc"..58 2.FOSFORILACÓN DE pRB"..59 V Activación de p110¿ y p110ß en ciclo celular"61 1.CINÉTICAS DE ACTIVACIÓN DE p110¿ y p110ß EN CICLO CELULAR..61 2.MECANISMOS DE ACTIVACIÓN p110¿ y p110ß EN CICLO CELULAR...62 VI Función de p110ß en la progresión de fase S "65 1. ESTUDIOS CON INHIBIDORES ESPECÍFICOS: PIK75 y TGX221"...65 2. ANÁLISIS DE LA PROGRESIÓN DE LA FASE S".66 3. ENSAYOS DE DNA combing"67 VII Mecanismos de la replicación del ADN regulados por p110ß..69 1.ANÁLISIS DEL ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO PRE-REPLICATIVO"69 2.ANÁLISIS DEL RECLUTAMIENTO DE PCNA A LA CROMATINA Y SU UNIÓN A POL¿"...70 3. FUNCIÓN ESPECÍFICA DE LA SUBUNIDAD p110ß EN LA DISOCIACIÓN DE COMPLEJOS p21CIP1/PCNA"..71 4. ANÁLISIS DE LA FOSFORILACIÓN DE p21CIP12..72 5. ANÁLISIS DE LA ESTABILIDAD DE p21CIP1".74 6. FUNCIÓN DE LA FOSFORILACIÓN DE T145 EN p21CIP12.76 7. MECANISMO POR EL QUE p110ß MEDIA LA FOSFORILACIÓN DE p21CIP1.77 VIII Origen de la especificidad de función de p110ß durante la replicación del ADN "78 1.LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE LAS ISOFORMAS p110ß "Y"p110¿..78 2.REGULACIÓN DE PKB NUCLEAR POR p110ß "78 DISCUSIÓN".81 I p110¿ regula los eventos tempranos de fase G1"...81 1.LA PROGRESIÓN DE G1 REQUIERE DOS PULSOS DE SEÑAL MITOGÉNICA "81 2. p110¿ REGULA LOS PROCESOS TEMPRANOS DE G1. "81 3. ACTIVACIÓN DE AKT POR p110¿ Y p110ß"...82 4. p110¿ REGULA CRECIMIENTO CELULAR"...82 5. SÍNTESIS DE CICLINAS DE G1/S Y FOSFORILACIÓN DE pRB"...83 6. MECANISMOS DE ACTIVACIÓN DE p110¿ Y p110ß".83 7.PI3K Y RAS"84 II p110¿ y p110ß regulan la transición G1/S"..............85 III Función de p110ß en la replicación del ADN"86 1.PI3K NUCLEAR"86 2. FOSFORILACIÓN DE p21CIP1"87 3. REGULACIÓN DE LOS NIVELES DE P21CIP1 POR PI3K".88 IV Origen de la especificidad de la función de las isoformas de PI3K "......................................................................89 1. TEJIDO Y TIPO CELULAR!89 2. MECANISMOS DE ACTIVACIÓN".89 3.FUNCIÓN ADAPTADORA1.89 4. ACTIVIDAD LÍPIDO QUINASA Y PROTEINA QUINASA".90 5. LOCALIZACIÓN SUBCELULAR".90 6.ESPECIFICIDAD DETERMINADA POR LA SUBUNIDAD REGULADORA..91 V p110¿ y p110ß : posibles dianas terapéuticas contra el cáncer!!........91 CONCLUSIONES"95 BIBLIOGRAFÍA"99 ANEXO".125