Análisis de la metilación del promotor del gen mgmt, en muestras de tejido y sangre de pacientes con glioblastoma, mediante pirosecuenciación
- Autores: Anna Estival González
- Directores de la Tesis: Carmen Balaña Quintero (dir. tes.), Carolina Sanz Monte (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Manuel Monreal Bosch (presid.), Ricard Mesía Nin (secret.), Oscar Gallego Rubio (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Medicina por la Universidad Autónoma de Barcelona
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
Antecedentes: El glioblastoma (GB) es el glioma maligno más frecuente. Mediante el tratamiento multidisciplinar con cirugía, radio y quimioterapia se consigue una supervivencia mediana de 15 meses. La metilación del promotor del gen O-6-Metilguanina-DNA-metiltransferasa (MGMT) es un conocido factor pronóstico y predictivo de respuesta a temozolomida en estos tumores, pero su análisis de manera repetida es complejo. Las rebiopsias cerebrales comportan un riesgo para el paciente, además, las muestras de tejido obtenidas pueden no representar la heterogeneidad tumoral. Los avances en el uso de biomarcadores en biopsia líquida la están posicionando como una solución a estos inconvenientes. La determinación de la metilación de MGMT se puede llevar a cabo con diversas técnicas, siendo la PCR específica de metilación (MSP) la más utilizada, tanto en ensayos clínicos como en la práctica diaria. La pirosecuenciación es una técnica sencilla y con resultados objetivos, que se ha demostrado útil para el análisis de esta alteración epigenética.
En este proyecto, hemos determinado el estado de metilación del promotor de MGMT, en muestras de tejido y en ctDNA de muestras sanguíneas, utilizando las técnicas de MSP y pirosecuenciación.
Metodología: Se analizó la metilación de MGMT en tejido y sangre de pacientes con GB. 81 muestras de tejido y 83 de sangre, fueron valoradas mediante MSP (CpG 74-78 y 84-87), mientras que 78 de tejido, 56 de suero y 55 de plasma, lo fueron mediante pirosecuenciación (CpG 74-78).
Para la pirosecuenciación, se consideraron dos puntos de corte con relevancia clínica: aquel que dividía la cohorte en dos grupos según la máxima diferencia en supervivencia global, llamado “mejor punto de corte”, y el porcentaje mínimo a partir del cual la metilación ya tenía un impacto clínico, llamado “punto de corte mínimo”. Ambos puntos de corte tenían significación estadística.
Resultados: El “mejor punto de corte” en tejido fue de 11,4%, mientras que el “punto de corte mínimo” fue de 5%. El 48,6% de casos fueron positivos para la metilación en tejido, mediante MSP y el 55,7% lo fue por pirosecuenciación. Ocho casos no metilados por MSP, se detectaron metilados por pirosecuenciación, mientras que en 3 muestras pasó a la inversa. Asimismo, 4 muestras no valorables por MSP tuvieron resultado por pirosecuenciación. En plasma, el “mejor punto de corte” para la pirosecuenciación fue 3,4%. 14,9% casos fueron metilados por MSP, mientras que el 28,6% lo fue por pirosecuenciación. El “mejor punto de corte” en suero fue de 1,6%, un valor inferior a las muestras de DNA no metilado comercial y sin correlación significativa con la supervivencia global. Por este motivo, el suero se descartó para análisis adicionales.
24 Conclusiones: La MSP y la pirosecuenciación, una vez definido el punto de corte, son dos métodos válidos para la determinación de la metilación del promotor del gen de MGMT, en tejido de pacientes con GB. Aunque la concordancia entre ellos no es perfecta, ambos ofrecen resultados que se correlacionan con la supervivencia y la respuesta al tratamiento con agentes alquilantes.
Por lo tanto, ambas técnicas son útiles para detectar pacientes que podrían beneficiarse de dichos tratamiento. Pese a que, en nuestro proyecto, se ha demostrado la presencia de ctDNA en sangre y plasma de pacientes con GB, la sensibilidad para la detección de la metilación de MGMT, con los dos métodos, es baja. El suero no es una buena fuente para la determinación de metilación de MGMT en ctDNA.
