Resumen de Transposones sb (sleeping beauty) y fp (frog prince): su aplicabilidad de la transferencia de adn a celulas de peces
TÍTULO DE LA TESIS: TRANSPOSONES SB (SLEEPING BEAUTY) Y FP (FROG PRINCE): SU APUCABIUDAD EN LA TRANSFERENCIA DE ADN A CÉLULAS DE PECES RESUMEN: La transferencia de ADN a células o embriones de peces tiene numerosas aplicaciones, tales como el análisis funcional de genes de interés, la obtención de biorreaclores o la pasible creación de peces transgénicos. En base a los éxitos obtenidos en ensayos previos al utilizar transposones 7c7 en la transformación de especies heterólogas, sobre todo de mamíferos, se estudia el posible papel de transposones tipo 7cf en la mejora de la integración y expresión de transgenes en el genomio de especies piscícolas. Para ello se evalúa la eficiencia de transposición de los sistemas SB y FP en lineas celulares de peces procedentes de especies filogenéticamente alejadas (CHSE-214, RTG-2, BF-2, EPC y SAF-1), usando para ello los ensayos de escisión y formación de colonias. Además se evalúan por ensayos directos la actividad del sistema SB, desarrollado a partir del genoma de salmónidos, en la línea CHSE-214 de salmón y se determina In vitro la capacidad del sistema SB para desarrollar un sistema de expresión en la línea CHSE-214 de salmón de la proteína Mx de lenguado (Sofea senegalensis). Básicamente se comprueba que las transposasas SB y FP son activas en las cinco líneas celulares de peces analizadas, en las que presentan un nivel de actividad discreto.No obstante, FP parece más útil que SB en la transferencia de ADN a especies piscícolas. En las líneas de salmónidos las transposa sas endógenas tipo Tc1 interfieren con la actividad de SB mediante un mecanismo de complement ación dominante negativa y estas transposa sas endógenas presentan cierta actividad transposicional en estas líneas celulares. Se comprueba que la línea celular CHSE-214 se revela como un sistema experimental atractivo para estudiar la interacción entre transposones de la familia 7c f y transposa sas endógenas. El transposón SB se revela como herramienta útil para el desarrollo de sistemas de expresión estable de proteínas recombinantes en las células CHSE-214 Los avances en la investigación sobre transposones están revolucionando la percepción de su naturaleza, de su función en la regulación de la expresión génica y de su significado como una fuerza creadora de novedades genéticas. Incluso se ha valorado su potencial evolutivo como "parásitos útiles" en la dimensión de linajes, de forma que algunos autores señalan la posibilidad de que episodios de alta actividad transposicional, podrían explicar la teoría de los equilibrios interrumpidos que sugieren datos paleontológicos. El conocimiento sobre la dinámica y evolución de los transposones de peces permitirá utilizarlos para desarrollar vectores para la manipulación genética, o diseñar nuevas aplicaciones biotecnológtcas, incluyendo algunas para acuicultura.
Fish cells stably expressing exogenous genes nave potential applications in the product!on of fish recombinant proteins, gene-function studies, gene-trapping and the product ion of transgenic fish. However, exprés si on of a gene of interest after random integration may be difficutt to predict or control. In the past decade major contri bufa" ons nave been made in vertebrate-gene transíer, by using tools derived from DNA transposons. Amono, them, the Steeping Beauty (SB) and Frog Prince (FP) transposons, derived respectively from fish and frog gen ornes, medíate transpositíon in a large variéty of cells, although with difieren! efhciency. This study was aimed at assessing the activities of the SB and the FP transposases in fish cefl lines from genefacally dístant species (CHSE-214, RTG-2, BF-2, EPC and SAF-1). Their transposrrJonal ability was evaluated by the plasmid-based excisión assay, the cotony formation assay and the footprint pattems. The results reveal that whíle both transposases are active "m all cell lines, the faansposífaon rates and the precisión of the transpositíon are overall higher with FP than SB. When SB activity was assessed by indirect a p proa ches in various fish cell lines, the salmonid CHSE-214 cells showed the poorest performance, whích was interpreted as due to high levéis of Tcl-áke endogenous transposases that were able to impair SB functionality. To further interpret this peculiar behaviour, in this study we aimed at characterizing SB-mediated integras ons in CHSE-214 cells, by colony formation assays, along with determining the number and precisión of transóositions that occurred in individual cells, by Southern blotrJng and sequencing of the integration sites. The results indicated a slight activity of SB in improving integration rates, although all sequences from single integrations dtd not show expected pattems, which mtght have resutted from either ¡Ilegitímate recombination or imprecise transpositíon. These findings support the pos si ble interference of SB activity by tne previously detected Tc1-like endogenous tranposases that rruglrt be acting as a barrí er for precise SB-mediated transpositíon. Because SB was obtained from a salmonid genome its use as a vector in heterologous organísms may be far more efficient and less likely to cause genontic instabílity. Finally, in this study aimed at evaluatíng the activity of 58 as an improving gene transfer method, for the estaMishment of expression stable cell clones in the salmonid cell line CHSE-214. The transgene that was chosen was that of the antiviral Mx proteín from the aquacuítured species Senegalese solé (Solea senegalensis). The results showed that SB proved effective for the establishment of clones homogeneously and stably expressing the SsMx recombinant protein, whose antiviral activity against Solé aquabirnavrrus was successfully tested.
