Metabolismo de esteroles glucosilados en plantas: efectos sobre el desarrollo y la tolerancia a estrés biótico
- Autores: Nidia Paola Castillo Vázquez
- Directores de la Tesis: Teresa Altabella Artigas (dir. tes.), Albert Ferrer Prats (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Rosa María Cusido Vidal (presid.), Amparo Monfort (secret.), Víctor Flors (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biotecnología por la Universidad de Barcelona
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
- español
Resumen Los esteroles libres y glucosilados son vitales para el mantenimiento de la correcta estructura y función de la membrana plasmática de las plantas. Previamente se ha relacionado a los esteroles glucosilados y las enzimas que participan en su biosíntesis, las esterol glucosil transferasas (SGT), con el crecimiento y desarrollo de las plantas, y su respuesta a diferentes estreses, aunque la información sobre los mecanismos a través de los cuales desempeñan estas funciones es aún limitada. En esta tesis se describe la identificación y caracterización funcional de cuatro genes de tomate (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) que codifican las isoenzimas denominadas SlSGT1-4; además, se examina el papel de la isoenzima SlSGT1 en el crecimiento y desarrollo de la planta y el fruto de tomate. Adicionalmente, se estudia la respuesta del doble mutante ugt80A2B1 de Arabidopsis thaliana, defectivo en los dos genes SGT de esta planta, a la infección por el hongo necrótrofo Botrytis cinerea.
La expresión de las isoenzimas SlSGT1-4 en E. coli y N. benthamiana demostró la capacidad de las cuatro enzimas para glucosilar los esteroles mayoritarios de las plantas. Además, el análisis transcriptómico demostró que los genes SlSGT1 y SlSGT3 se inducen durante el crecimiento y desarrollo de la planta y el fruto de tomate, mientras que SlSGT2 y SlSGT4 se inducen en respuesta a tratamientos con frío, manitol, sal, ácido abscísico y metil jasmonato. Por su parte, estudios de localización subcelular basados en la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo, junto con análisis de fraccionamiento subcelular, revelaron que las cuatro SlSGT se distribuyen entre el citosol y la membrana plasmática: las isoenzimas SlSGT2 y SlSGT4, codificadas por los genes que se inducen por estrés, se localizan mayoritariamente en el citosol, mientras que las isoenzimas SlSGT1 y SlSGT3, codificadas por los genes que se expresan diferencialmente durante el desarrollo de la planta y no responden a estrés, se encuentran principalmente asociadas a la membrana plasmática. Además, el silenciamiento mediante amiRNA de la expresión de SlSGT1, el gen que presenta mayores niveles de expresión en todos los tejidos de la planta y etapas de desarrollo del fruto analizados, provoca una disminución del contenido de esteroles glucosilados asociado a un fenotipo de enanismo moderado en la planta y una disminución del tamaño del fruto. En conjunto, los resultados obtenidos sugieren que las SlSGT desempeñan funciones solapantes pero no completamente redundantes y que desempeñan un papel importante en el desarrollo y crecimiento de la planta y el fruto del tomate, y en las respuestas de la planta frente a diferentes condiciones de estrés biótico y abiótico.
También se ha demostrado que el mutante ugt80A2B1 de A. thaliana exhibe una resistencia aumentada en comparación con plantas wild type a la infección por B. cinerea, que se correlaciona con niveles aumentados de ácido jasmónico (JA) y la inducción de los genes marcadores de defensa PDF1.2 y PR4 de la rama ERF de la vía de señalización de JA, y niveles más altos de camalexina en comparación con las plantas wt, asociados a una mayor expresión de varios genes biosintéticos de camalexina y sus reguladores transcripcionales WRKY33, ANAC042 y MYB51. Asimismo, se detectó una mayor inducción en la expresión de los genes implicados en la biosíntesis de indol glucosinolatos. Esto demuestra que la homeostasis de esteroles glucosilados desempeña un papel importante en la regulación de la respuesta de Arabidopsis a la infección por B. cinerea, que parece estar mediada por vías de señalización reguladas a nivel transcripcional por JA que resultan en la acumulación de camalexina e indol glucosinolatos.
En conjunto, los resultados de este estudio establecen las bases para estudios posteriores dedicados a comprender el mecanismo de acción de los esteroles glucosilados y las SGT en estos procesos fisiológicos.
- English
Abstract Free and glycosylated sterols are key components to maintain the structure and function of the plant plasma membrane. Previous studies have shown that glycosylated sterols, as well as the enzymes sterol glycosyltransferases (SGT), involved in their biosynthesis, play an essential role in plant growth and development, and in its response to different types of stress, although the information about the mechanisms through which these functions are performed is still very limited. This thesis describes the identification and functional characterization of four tomato (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) genes, coding for the so-called SlSGT1-4 isoenzymes. In addition, this work examines the role of the isoenzyme SlSGT1 in tomato plant and fruit. Furthermore, the response of Arabidopsis thaliana ugt80A2B1 double mutant, defective in the two SGT genes of this plant, against the necrotrophic fungus Botrytis cinerea infection, is also studied.
Expression of SlSGT proteins in E. coli cells and N. benthamiana leaves demonstrated the ability of the four enzymes to glycosylate mayor plant sterols. Moreover, transcriptomic analysis showed that SlSGT1 and SlSGT3 are induced during tomato plant and fruit growth and development, while SlSGT2 and SlSGT4 are induced in response to cold, salt, mannitol, abscisic acid, and metil jasmonate treatments. Subcellular localization studies based on fluorescence recovery after photobleaching, together with subcellular fractionation analysis, revealed that the four SlSGTs are distributed between the cytosol and the plasma membrane: the isoenzymes SlSGT2 and SlSGT4 encoded by genes induced by stress, localize into the cytosol, while SlSGT1 and SlSGT3, encoded by genes differentially expressed during plant development, which are unresponsive to stress, are mainly associated with the plasma membrane. Furthermore, amiRNA silencing of SlSGT1 expression produces a decrease in glycosylated sterols content and is associated to a moderate dwarfism phenotype in the plant, and a decrease in fruit size. These results suggest that SlSGT perform overlapping but not completely redundant biological functions involved in the regulation of the tomato plant and fruit growth and development, and in the plant response to different biotic and abiotic stresses.
Additionally, after infection with the necrotrophic fungus Botrytis cinerea, A. thaliana ugt80A2B1 double mutant exhibits an increased resistance to the pathogen compared to wild type plants, which correlates with increased levels of jasmonic acid (JA) and with the up-regulation of defense marker genes PDF1.2 and PR4 of the ERF branch from the JA signaling pathway. In addition, ugt80A2B1 plants also accumulate higher levels of camalexin compared to wt plants, which correlates with higher levels of expression of several biosynthetic genes of camalexin, as well as with its transcriptional regulators WRKY33, ANAC042 and MYB51. Furthermore, there was a higher up-regulation of indole-glucosinolate biosynthetic genes in the ugt80A2B1 mutant compared to wt plants. This demonstrates that glycosylated sterol homeostasis plays an important role in the regulation of Arabidopsis response against B. cinerea infection, and suggests that this response is mediated through signaling pathways regulated at transcriptional level by JA, resulting in the accumulation of camalexin and indole glucosinolates.
Overall, the results of this study set the bases for further studies devoted to understanding the mechanism of action of glycosylated sterols and SGT in these physiological processes.
- español
