Development of a novel 3d electroohi¡oresis assisted litography to pattern hydrogel scaffolds, for t issue engineering and biomaterials
- Autores: Juan Aguilar
- Directores de la Tesis: Fernando Albericio Palomera (dir. tes.), Alvaro Mata Echevarria (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Carlos Eduardo Semino Margrett (presid.), Maria Pau Ginebra i Molins (secret.), Arturo Santos Garcia (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina por la Universidad de Barcelona
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: TESEO
- Resumen
Introducción En las últimas décadas, ha crecido el interés en desarrollar y estudiar biomateriales que mimeticen y recreen la matriz extracelular. La Matriz Extracelular (ECM) es una serie de compuestos que promueven el crecimiento, proliferación, diferenciación y guía a las células que están a su alrededor. Así mismo, la ECM, promueve la movilidad de las células la interacción de éstas con su entorno y con ellas mismas, así mismo les da soporte físico-químico. En la Actualidad, hay un gran interés en poder mimetizar este componente para aprender y entender como las células se comportan fuera de su entorno nativo, en un entorno in vitro. Por ende, materiales como los hidrogeles han sido desarrollados. Éstos tienen una gran capacidad de absorber agua (componente principal de la ECM); así mismo puedes modular su estabilidad mecánica-física anteponiendo los tipos de entrecruzamiento que podría sufrir el polímero precursor del hidrogel. Estudios marcados en la literatura, describen que éste tipo de materiales son idóneos para generar cultivos 3D de células mamíferas, así mismo hacer estudios de crecimiento celular guiado, regeneración de tejido, procesos biológicos o suministrar moléculas.
En la actualidad los cultivos celulares se hacen en un ambiente bidimensional, sobre una superficie rígida y plástica. No obstante, las células en un estado nativo se encuentran sumergidas en un entorno tridimensional. A pesar de ello, los avances en la tecnología, han originado que los cultivos 2D sean cada vez más sofisticado, anteponiendo patrones moleculares para modular la adhesión celular. Ahora, el reto ésta en crear esa misma complejidad de patrones moleculares en ambientes 3D. Para ello, tecnologías como la impresión 3D, la estereolitografía, reacciones secuenciales tipo click y el fotopatronaje aditivo, abrieron la posibilidad de crear estos ambientes complejos. No obstante, todas las técnicas descritas anteriormente, son complejas, inciden con el uso de ultravioleta y necesitas elaborar el hidrogel capaz de adaptarse a la técnica que lo patronizará. Para evadir, principalmente el uso de ultravioleta, han surgido técnicas que hacen uso de los campos eléctricos ya sean en corriente alterna como la dielectroforesis, o corriente directa como la electroforesis.
Objetivos Este proyecto tiene como objetivo alcanzar el desarrollo de una técnica multimaterial, asequible, versátil y novedosa. Que permita construir entornos tridimensionales para cultivo celular. Finalmente, estos entornos estarán construidos por medio de una técnica que imprimirá moléculas que funcionalizarán a los hidrogeles impresos.
Resultados y discusión.
Se han desarrollado y evaluado una tecnica con dos modalidades que permiten la impresión de macromoléculas a través de hidrogeles. Para ello, se ha explotado la electroforesis como principal efecto para arrastrar las moléculas (principalmente proteínas)a través de los hidrogeles. A partir de ello se ha generado la técnica llamada Electroforesis tridimensional asistida por litografía ya sea en modo con tubos o modo con máscara. En modo con tubos comprende la inserción de pequeños tubos que guían la molécula a imprimir a través del hidrogel. Por otro lado, el modo máscara es la alternativa que permite definir las formas a imprimir a través de huecos (con forma) hechos previamente en la máscara. Ambas modos explotan el efecto de la electroforesis, para el modo tubo se utilizo una cubeta vertical de electroforesis, que permitía sumergir el hidrogel a imprimir en una solución taponadora y la colocación de electrodos para suministrar el campo eléctrico. Por otro lado en el modo máscara, se uso una membrana de diálisis, la cual es permeable a los iones (que inducen el campo eléctrico) pero no permeable la molécula a imprimir. Para esté modo fue necesario construir un dispositivo que permitiera contener la solución taponadora, forzar al flujo pasar por el hidrogel a patronizar y que estuvieran los electrodos sumergidos en la solución para poder accionar el campo eléctrico. Para ello se usaron cubetas con capacidad de 500 ml, electrodos de platino, y una cápsula de fondo plano conectada a un tubo de seguridad, los cuales cada una de sus extremidades iban conectadas a una manguera, las cuales iban conectada a las cubetas de las solución taponadora. Así mismo, para entender aún más el efecto de la máscara se hicieron simulaciones matemáticas utilizando ecuaciones que describen el efecto electroforético y el arreste molecular. Todas las simulaciones fueron corroboradas con experimentos, resultando que los patrones que sostienen mejor la forma (con poca dispersión) se obtienen cuando la membrana tiene un corte de peso molecular en el límite del peso molecular de la molécula a imprimir; dado que da mayor permeabilidad a los iones, generando un campo eléctrico más uniforme, pero sigue siendo impermeable a la molécula a imprimir.
Para evaluar la versatilidad del modo tubo se imprimieron diferentes proteínas como una elastina y anticuerpos secundarios flourecentes. Así mismo para generar figuras más complejas el campo eléctrico se bloqueo con una pieza de polidimetilsiloxano, ocasionando que se generase un patrón con una curva a través de un hidrogel de agarosa. Por otro lado se logro generar un patrón cruzado , donde dos patrones tubulares fueron impresos de manera horizontal y uno de manera vertical, cruzando la vertical a uno de los patrones horizontales. Finalmente la multimaterialidad en éste modo se evaluó imprimiendo sobre agarosa, poliacrilamida y quitosano. Para el modo máscara la impresión fue evaluada formando patrones de 150 micras a través de hidrogeles de poliacrilamida, así miso se generaron patrones cuadrados de 200 X 200 X 200 micras y patrones cilíndricos de 30 micras con una profundidad de 60 micras. Diferentes moléculas como la el anticuerpo secundario fluorescente, así como fibronectina fueron impresos sobre agarosa, poliacrilamida, pelietenglicol diacrilato, y compósitos de poliacrilamida con quitosano, colágeno y gelatina, respectivamente. Cada hidrogel fue impreso con patrones cilíndricos de 150 micras de diámetro y 50 mm de profundidad. Se observo, que en los hidrogeles que tenían menos afinidad por la molécula, la dispersión era más alta, mientras en los geles que tenían gelatina, quitosano o colágeno la dispersión era mucho más baja, dado la afinidad de la molécula a éstos polímeros. Para evaluar la funcionalidad, la posibilidad de crear ambientes celulares, en el modo tubo se imprimió sobre agarosa un patrón de elastina secuenciada con el péptido RGDS, que promuévela adhesión celular. Después de inocular células de médula ósea de ratón con medio de cultivo libre de suero fetal bovino, se observaron a las cuatro horas, células con su citoplasma abierto reconociendo la zona donde se encontraba la elastina. No obstante, al recambiar el medio, las células fueron removidas, dado que la elastina no estaba adherida a la agarosa, por su baja afinidad entre ambas. Por otro lado utilizando el modo máscara se logro generar un ambiente con 30 patrones cilíndricos de fibronectina mezclada con fibronectina fluorescente, con un diámetro de 150 micras y una profundidad de 1000 micras, en un hidrogel de poliacrilamida gelatina y poliacrilamida colágeno. En ambos geles se observo el reconocimiento de células NIH-3T3 sobre los patrones. Se dejaron proliferar por 4 y 14 días respectivamente, observando en el hidrogel de poliacrilamida-gelatina, los patrones invadidos con células sin necesidad de microscopio o algún sistema de aumento; mientras en el gel de poliacrilamidad-colágeno se valido la migración celular hasta 100 micras. Para abrir la oportunidad de generar ambientes más complejos, con la modalidad máscara; se generó un cocultivo entre células HEPG2 y 3T3; donde las 3T3 representan el tejido no parenquimoso y las HEPG2 el tejido parenquimoso. Para ello se creo un hidrogel al 4% de poliacrilamida y al 0.01% de colágeno con 30 patrones de fibronectina de 150 micras de diámetro y 1 mm de profundidad. Inmediatamente después de imprimir los patrones se inoculó el hidrogel con fibronectina y al tercer día se permeo el hidrogel con fibronectina en suspensión y se inoculó ese mismo cultivo con las 3T3. Al sexto día se detuvo el cultivo, observando dispersión en el patrón, pero proliferación de las 3T3 donde no había patrones y las HEPG2 donde había. Finalmente, el 3DEAL permite imprimir patrones sobre hidrogeles, por lo tanto se abre la posibilidad de crear ambientes biomiméticos para el descubrimiento de nuevos fármacos, estudios de regeneración la ingeniería de tejidos, entender patologías crónicas como el cáncer, generar modelos de traumatismo o regeneración de tejido, fibrosis, recuperación, inflamación, entre otros. Conclusión Se ha desarrollado una técnica capaz de construir ambientes biomiméticos para cultivamos tridimensionales de cuélalas en hidrogeles explotando el efecto de la electroforesis. Se han desarrollado dos modos, y ambos han sido evaluados para catalogarlos como multimaterial, versátil, asequible y novedosos. La multimaterialidad de los modos, fue alcanzada gracias a que la técnica permite imprimir en diferentes tipos de hidrogeles. Por otro lado, la versatilidad fue evaluada por su mecanismo de impresión y los diferentes patrones y formas hechas por medio de ambos modos (tubos y máscara). Asequibilidad de esta técnica está comprobada por sus materiales de fácil acceso en cualquier laboratorio de química húmeda, proteómica, biología molecular, entre otros, así mismo que puede desarrollarse sobre cualquier poyata de éstos mismo laboratorios. Finalmente, lo novedoso, fue evaluado por la comparación del estado del arte que permitió que la técnica fuera patentada en la Unión Europea y Estados Unidos de América. Se cree que el 3DEAL permitirá entender y explorar cultivos celulares más próximos a como se encuentran en estado nativo y con ello expandir el conocimiento a lo que compete las áreas de ingeniería tisular, biomateriales y la medicina regenerativa.
