Metabolic reprogramming in arbuscular mycorrhizal symbiosis for enhanced resistance and tolerance against stresses
- Autores: Javier Rivero Bravo
- Directores de la Tesis: M. Jose Pozo Jiménez (codir. tes.), Víctor Flors (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2019
- Idioma: inglés
- ISBN: 9788413062471
- Número de páginas: 232
- Títulos paralelos:
- Reprogramación metabólica en simbiosis de micorrizas arbusculares para mejorar la resistencia y la tolerancia a estreses
- Tribunal Calificador de la Tesis: Concepción Azcón González de Aguilar (presid.), Juan Manuel Ruiz Sáez (secret.), Mª Victoria Pastor Fuentes (voc.), Iván Fernández López (voc.), Pierre Pétriacq (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Fundamental y de Sistemas por la Universidad de Granada
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
- Resumen
Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are microscopic soil organisms able to establish a mutualistic association with the roots of most vascular plants, known as arbuscular mycorrhiza (AM). This symbiosis has been of extreme importance for plants along the evolutionary process. For example, it is thought that they facilitated plants adaptation to land environment over 450 million years ago. Due to their biotrophic nature, AMF need the photosynthates from the host plant for a correct development and functionality of their symbiotic structures. In return, many benefits are provided to the host plant, as the well-studied enhanced mineral nutrition (Giovannetti et al., 2017).
Plant advantages derived from the symbiosis go far beyond nutritional aspects. Mycorrhizal plants have shown a better tolerance and resistance against a broad range of environmental stresses caused by both abiotic (e.g. drought or salinity) and biotic (pests and pathogens) factors (Jung et al., 2012; Ruiz-Lozano et al., 2016). Mechanisms mediating AM-benefits are diverse and depend on the stress situation, and in most cases, are reported to be finely regulated by phytohormones (Pozo et al., 2015). In addition, although AMF are generalists, a functional diversity has been described, with some fungi being more efficient than others in terms of benefits for a given host plant species or growth conditions. Thus, the final output of the symbiosis is determined by the plant-AMF genotypes and the imposed stress. Considering this complexity, greater effort is needed to unravel the mechanisms underlying this increased ability of the host plant to overcome adverse situations. This knowledge will contribute to promote the use of AM-inoculants as biostimulants and bioprotectors in agriculture as an environmentally-friendly alternative to the traditional crop management, highly dependent on chemical fertilizers and pesticides.
Nowadays, the study of metabolic rearrangement in plants subjected to stress is as a useful tool to understand the molecular mechanisms involved in stress tolerance. Plants display a considerable phenotypic (physiological and chemical) plasticity to adapt to deleterious conditions. Indeed, biosynthesis of certain secondary metabolites, such as toxins or osmoprotectant compounds, can be crucial for plant adaptation to stress growing conditions (Yang et al., 2018a). Therefore, those stimuli able to increase such metabolic plasticity, will result in a better plant adaptation to the challenging environment (Gratani, 2014). In this regard, previous studies have reported how AM can induce an “alert state” in the host plant with minimal fitness costs, that leads to a faster and stronger activation of plant defenses upon aggressor attack, known as defense priming (Martínez-Medina et al., 2016; Mauch-Mani et al., 2017).
To better understand the changes in the plant metabolism that may coordinate the enhanced stress tolerance, we used an untargeted metabolomic approach through liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS). This technique has proved to be an excellent tool for the identification of a wide range of secondary metabolites differentially accumulated, providing valuable information about how plants alter their metabolism to respond adequately to different environmental stimuli (Tugizimana et al., 2018).
Therefore, the present Doctoral Thesis focuses on the study of the potential of mycorrhizal fungi to protect tomato plants against different stresses, exploring the metabolic rearrangement underlying such protection, with the aim of identifying metabolic pathways and compounds playing a key role in the increased tolerance/ resistance of AM-plants.
To achieve this main objective, we performed a series of experiments studying the performance of tomato plants colonized by different AMF (Funneliformis mosseae, Rhizoglomus irregulare and Claroideoglomus etunicatum), under different growth conditions, including non-stress, moderate and severe abiotic stress (drought and salinity) and a biotic stress consisting on herbivory by the leaf chewing insect Spodoptera exigua. The experiments were complemented by untargeted metabolomic studies to characterize the plant response to the specific stress and explore any potential difference between mycorrhizal and non-mycorrhizal plants that may explain their improved resilience to overcome stress.
Firstly, we explored the changes in the metabolism of the host roots as a consequence of the symbiosis establishment. This fact is important, since it will allow us to differentiate between common and AMF-specific basal metabolic changes of those related to stress responses analyzed in the following experiments. This study is presented in the Chapter 1 (Rivero et al., 2015), where the metabolic profiles of roots colonized by F. mosseae or R. irregulare were compared with those from non-mycorrhizal plants. A strong metabolic rearrangement was observed, where a shared core of overaccumulated metabolites was found in roots colonized by both AMF. Those compounds were mainly associated to defense related pathways including phenylpropanoids (lignins, lignans and phenylpropanoid-polyamine conjugates (PPCs)), oxylipins (responsible of synthesis of jasmonic acid (JA)) and benzylisoquinoline alkaloids (BIAs). In addition, besides this shared modulation, fungus-specific fingerprints were also found, which may be underlying the reported functional diversity among different AMF species.
Subsequently, Chapter 2 compiles a series of experiments carried out under progressive levels of drought and salinity stresses (Rivero et al., 2018). In this study, we included a C. etunicatum strain isolated from high-salinity and very dry soil in addition of the previously studied F. mosseae and R. irregulare. Inoculation with each tested AMF increased plant tolerance to drought and salinity, resulting the positive effect of the symbiosis strongest under the most severe stress conditions. Interestingly, C. etunicatum-colonized plants displayed the best performance upon salinity stress, being the most effective AMF excluding toxic Na+ in aboveground tissues. This fact reinforces the concept of functional diversity among AMF species, while emphasizing the importance of inoculating with stress-adapted strains to maximize plant protection.
Remarkably, although both stresses had a similar impact in terms of biomass loss, only salinity produced a significant alteration in the secondary metabolism of the roots. The roots colonized by the salt-adapted C. etunicatum exclusively exhibited a differential accumulation of some metabolites likely related to stress, that were not detected in the other mycorrhizal plants (which could explain the strongest protection). However, since all AMF strains achieved a significant protection, and our interest is in identifying mycorrhiza mechanisms for stress protection, we focused our analysis on those metabolites with a common altered pattern in roots colonized by the three AMF. A B6 vitamer, flavanols, xanthones and lignans were found overaccumulated in all mycorrhizal plants only upon salinity stress (primed response), thus they were considered as good candidates in mediating AM-protection. In a subsequently assay, we confirmed the protective role of flavanol catechin and B6 vitamers against salt stress through exogenous application of the compounds to tomato plants. These results confirmed that the mycorrhizal symbiosis enhance the metabolic plasticity of the plants improving their ability to cope with abiotic stresses.
Finally, the possible modulation of the host metabolic response during Mycorrhiza Induced Resistance (MIR) against biotic stress has been assessed in Chapter 3. Previous studies reported how necrotrophic pathogens and leaf-chewing insects may be negatively impaired in their development when they feed on a mycorrhizal plant (Song et al., 2013; Sánchez-Bel et al., 2016). These studies evidenced the role of phytohormone jasmonic acid (JA) in mediating MIR. However, an overview of the metabolic routes modulated in leaves leading to MIR remain elusive. In our study model, MIR against herbivore attackers was evidenced. The larvae from the common pest S. exigua fed on F. mosseae-colonized tomato plants displayed higher mortality and delayed development than those fed on non-mycorrhizal plants.
The subsequent untargeted metabolomic study allowed to explore the metabolic reprogramming triggered in response to herbivory locally in damaged tissues, and systemically, in distal leaflets. The analysis revealed a set of compounds only overaccumulated in AM-plants in response to local damage. Among the metabolic alterations, it was noteworthy the presence of several primed compounds within three main families: alkaloids, fatty acids derivatives and phenylpropanoid-polyamine conjugates (PPCs). Because of their specific accumulation profile and reliable identification, we focused on PPCs, more specifically in feruloylputrescine (FP), since was previously suggested to play a role in plant defense against herbivory (Kaur et al., 2010). Through pharmacological and genetic approaches, we confirmed that FP accumulation is JA-dependent, and we demonstrate that JA-signaling is required for the FP-priming triggered during MIR.
In summary, the study performed in this PhD Thesis demonstrate the protective ability of mycorrhizal fungi on plants of agronomic importance such as tomato, supporting their potential as biostimulants for sustainable agriculture. It also illustrates that the protection to not relate to a fixed, specific metabolic pathway. In contrast, the metabolic pathways altered and the metabolites showing a primed accumulation in mycorrhizal plants vary according to the stress conditions faced by the plant. Therefore, the mycorrhizal symbiosis enhances the metabolic plasticity of the plant allowing a more efficient activation of defenses. This major plasticity explains the broad character of the protection conferred by mycorrhiza, and thus, support their application as bioprotectors agents under multiple adverse conditions.
Los hongos formadores de micorrizas arbusculares (AMF, del inglés “Arbuscular Mycorrhizal fungi”) son organismos microscópicos del suelo capaces de establecer una asociación mutualista con las raíces de la mayoría de las plantas vasculares, conocida como micorriza arbuscular (AM, del inglés “Arbuscular Mycorrhiza”). Esta simbiosis ha sido de suma importancia para las plantas a lo largo del proceso evolutivo. Por ejemplo, se cree que facilitaron la adaptación de las plantas al entorno terrestre hace más de 450 millones de años. Debido a su naturaleza biotrófica, los AMF necesitan de los fotosintatos de la planta hospedadora para mantener un correcto desarrollo y funcionalidad de sus estructuras simbióticas. A cambio, proporcionan un gran número de beneficios a la planta hospedadora, destacando la bien estudiada mejora de la nutrición mineral (Giovannetti et al., 2017).
Las ventajas para las plantas derivadas de la simbiosis van mucho más allá de los aspectos meramente nutricionales. Las plantas micorrizadas muestran una mejor tolerancia y resistencia frente a una amplia gama de estreses ambientales causados por factores abióticos (por ejemplo, sequía y salinidad) y bióticos (plagas y patógenos) (Jung et al., 2012; Ruiz-Lozano et al., 2016). Los mecanismos que median dichos beneficios pueden ser diversos y dependientes del tipo de estrés y, en la mayoría de los casos, están finamente regulados por las fitohormonas (Pozo et al., 2015). Además, aunque los AMF son generalistas, diversos estudios han descrito su diversidad funcional, mostrándose ciertos hongos más eficientes que otros en cuanto a los beneficios aportados para una determinada especie de planta o condiciones de crecimiento. Por lo tanto, el resultado final de la simbiosis se encuentra determinado por los genotipos del AMF, planta hospedadora y las condiciones ambientales. Teniendo en cuenta esta complejidad, se necesita un mayor esfuerzo para dilucidar los mecanismos subyacentes a esta mayor capacidad de las plantas hospedadoras para superar condiciones adversas. Este conocimiento contribuirá a promover el uso agrícola de inoculantes micorrícicos como bioestimulantes y bioprotectores, representando una alternativa respetuosa con el medio ambiente frente al manejo tradicional de cultivos, altamente dependiente de los fertilizantes químicos y pesticidas.
Hoy en día, el estudio del reordenamiento metabólico que tiene lugar en plantas sometidas a estrés es una herramienta útil para comprender los mecanismos moleculares involucrados en la tolerancia o resistencia frente a los mismos. Las plantas pueden mostrar una considerable plasticidad fenotípica (tanto fisiológica como química) para adaptarse a diferentes condiciones perjudiciales. De hecho, la biosíntesis de ciertos metabolitos secundarios, como toxinas u otros compuestos osmoprotectores, puede ser crucial para la adaptación de la planta a condiciones de crecimiento estresantes (Yang et al., 2018a). Por lo tanto, aquellos estímulos capaces de aumentar dicha plasticidad metabólica producirán una mejor adaptación de la planta ante entornos hostiles (Gratani, 2014). En este sentido, estudios previos han descrito cómo las AM pueden inducir un "estado de alerta" en la planta hospedadora, con un coste mínimo para su fitness, que finalmente conduce a una activación más rápida y fuerte de sus defensas tras una agresión, conocida como precondicionamiento o priming defensivo (Martínez-Medina et al., 2016; Mauch-Mani et al., 2017).
Para comprender mejor los cambios en el metabolismo de las plantas que pueden coordinar la mayor tolerancia al estrés, utilizamos una aproximación metabolómica no dirigido a través de cromatografía líquida en tándem con espectrometría de masas (LC-MS). Dicha técnica ha demostrado ser una herramienta excelente para el estudio e identificación de una amplia gama de metabolitos secundarios acumulados de manera diferencial, proporcionando información valiosa acerca de cómo las plantas alteran su metabolismo para responder adecuadamente a diferentes retos ambientales (Tugizimana et al., 2018).
Por todo ello, la presente Tesis Doctoral se centra en el estudio del potencial de los hongos formadores de micorrizas arbusculares para proteger las plantas de tomate frente a distintos estreses, explorando la reorganización metabólica subyacente a dicha protección, con el objetivo de identificar rutas metabólicas y compuestos que desempeñen un papel clave en el aumento de la tolerancia y resistencia de las plantas micorrizadas.
Para lograr este objetivo principal, llevamos a cabo una serie de experimentos para estudiar el desempeño de plantas de tomate micorrizadas por diferentes AMF (Funneliformis mosseae, Rhizoglomus irregulare y Claroideoglomus etunicatum) durante distintas condiciones de crecimiento, que incluyen ausencia de estrés, estreses abióticos moderados y severos (sequía y salinidad), y estrés biótico consistente en herbivoría por el insecto masticador de hojas Spodoptera exigua. Los experimentos se complementaron con estudios metabolómicos no dirigidos para caracterizar la respuesta de la planta frente a cada estrés específico y explorar cualquier potencial diferencia entre las plantas micorrizadas y no micorrizadas que puedan explicar su mayor habilidad para superar el estrés.
En primer lugar, exploramos los cambios en el metabolismo de las raíces de la planta hospedadora como consecuencia del establecimiento de la simbiosis. Este hecho es importante, ya que nos permitirá diferenciar entre los cambios metabólicos basales comunes de los específicos para cada AMF, además de aquellos relacionados con las respuestas frente a cada estrés que se analizarán en los siguientes experimentos. Dicho estudio se presenta en el Capítulo 1 (Rivero et al., 2015), donde comparamos los perfiles metabólicos de raíces de tomate colonizadas por F. mosseae o R. irregulare con los de plantas no micorrizadas. En este trabajo encontramos una fuerte reorganización metabólica, observándose metabolitos comunes mayormente acumulados en las raíces colonizadas por ambos AMF. Esos compuestos pertenecían principalmente a rutas biosintéticas relacionadas con defensa, incluyendo fenilpropanoides (ligninas, lignanos y conjugados de fenilpropanoide-poliamina (PPCs)), oxilipinas (responsables de la síntesis del ácido jasmónico (JA)) y alcaloides bencilisoquinolínicos (BIAs). Además, más allá de estos cambios comunes, también observamos alteraciones específicas para cada hongo que podrían ser las responsables a la diversidad funcional descrita entre diferentes especies de AMF.
Posteriormente, a lo largo del Capítulo 2 realizamos una serie de experimentos sometiendo las plantas de tomate a niveles progresivos de estrés por sequía y salinidad (Rivero et al., 2018). En dicho estudio incluimos una cepa de C. etunicatum aislada de suelos de áreas con elevada salinidad, además de los AMF F. mosseae y R. irregulare estudiados en el capítulo previo. Durante el ensayo todos los AMF incrementaron la tolerancia de la planta frente a ambos estreses, siendo el beneficio aportado por la simbiosis más fuerte cuanto más severas las condiciones. Curiosamente, las plantas colonizadas por C. etunicatum mostraron el mejor desempeño ante estrés salino, siendo el AMF más efectivo excluyendo el ión tóxico Na+ de los tejidos de la parte aérea. Este hecho refuerza el concepto de diversidad funcional entre distintas especies de AMF, al tiempo que enfatiza la importancia de desarrollar inoculantes a partir de cepas adaptadas al estrés para maximizar la protección de las plantas.
Sorprendentemente, aunque ambos estreses tuvieron un impacto similar en cuanto a reducción de biomasa de la planta, solo la salinidad produjo una alteración significativa en el metabolismo secundario en las raíces. Las raíces colonizadas por C. etunicatum, el AMF adaptado a salinidad, exhibieron una acumulación diferencial de algunos metabolitos no observada en las otras plantas micorrizadas, probablemente relacionados con el estrés (lo que podría explicar la mayor protección). Sin embargo, dado que todas las especies de AMF lograron una protección significativa y que nuestro interés es identificar los mecanismos generales por los que las micorrizas protegen frente al estrés, centramos nuestro análisis en aquellos metabolitos con un patrón de alteración común para los tres AMF estudiados. Se observó una mayor acumulación de vitámeros B6, flavanoles, xantonas y lignanos en respuesta a salinidad para todas las plantas micorrizadas (respuesta priming), por lo que estos compuestos fueron considerados buenos candidatos para mediar la protección en AM. En un ensayo posterior, confirmamos el papel protector frente a estrés salino de la catequina y varios vitámeros B6 mediante su aplicación exógena en las plantas de tomate. Estos resultados constataron que la simbiosis micorrícica aumenta la plasticidad metabólica de las plantas, mejorando por ello su capacidad para hacer frente al estrés abiótico.
Por último, en el Capítulo 3, evaluamos la posible modulación de la respuesta metabólica en la planta hospedadora durante la resistencia inducida por micorrizas (MIR, del inglés “Mycorrhiza-Induced Resistance”) frente a estrés biótico. Se ha descrito en estudios previos cómo los patógenos necrotróficos y los insectos masticadores de hojas pueden verse perjudicados en su desarrollo cuando se alimentan de plantas micorrizadas (Song et al., 2013; Sánchez-Bel et al., 2016). Dichos trabajos evidencian el papel de la fitohormona ácido jasmónico (JA) en la mediación de MIR. Sin embargo, la visión general de las rutas metabólicas moduladas en tejidos aéreos que conducen a la MIR permanece aún desconocida. En nuestro modelo de estudio, se evidenció MIR frente a estrés por herbivoría. Las larvas de la plaga común S. exigua que se alimentaron en plantas de tomate colonizadas por F. mosseae mostraron una mayor mortalidad y retraso en su desarrollo que aquellas alimentadas con plantas no micorrizas.
El posterior estudio metabolómico no dirigido nos permitió explorar la reprogramación metabólica desencadenada en respuesta a la herbivoría en tejidos dañados (local) y en los foliolos adyacentes sin daños (sistémico). El análisis reveló un conjunto de compuestos con mayor acumulación solo en las plantas micorrizadas tras respuesta al daño local. Entre las alteraciones metabólicas, cabe destacar la presencia de tres familias principales de compuestos con varios metabolitos primeados: alcaloides, derivados de ácidos grasos y PPCs. Debido a su perfil de acumulación y su buena identificación, nos centramos en los PPCs, más específicamente en la feruloilputrescina (FP), ya que previos estudios habían sugerido que desempeñan un papel en la defensa de las plantas frente a herbivoría (Kaur et al., 2010). A través de aproximaciones farmacológicas y genéticas, confirmamos que la acumulación de FP es dependiente de JA, y demostramos que la señalización por JA es necesaria para el priming de FP durante la MIR.
En resumen, el estudio llevado a cabo en la presente Tesis Doctoral demuestra la capacidad de los hongos micorrícicos para proteger frente a diversos estreses a una planta de importancia agronómica como el tomate, lo que respalda su potencial uso como bioestimulantes para una agricultura sostenible. También ilustra que la protección proporcionada no puede relacionarse con una ruta metabólica específica y fija. Al contrario, las vías metabólicas alteradas y los metabolitos mostrando una acumulación potenciada (comportamiento priming) en plantas micorrizadas pueden variar dependiendo de qué condiciones de estrés enfrenta la planta. Por lo tanto, la simbiosis micorrícica arbuscular aumenta la plasticidad metabólica de la planta, permitiéndole una activación más eficiente de las defensas. Esta mayor plasticidad explica el amplio rango de protección conferida por las micorrizas y, por lo tanto, respalda su aplicación como agentes bioprotectores frente a múltiples condiciones adversas.
