Repercusiones funcionales de la interacción entre mutantes del canal nav 1.5 responsables del síndrome de brugada y los canales kir 2.X

• Autores: Marta Pérez Hernández Duran
• Directores de la Tesis: Ricardo Caballero Collado (dir. tes.), Juan Tamargo Menéndez (dir. tes.), María Eva Delpon Mosquera (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: F. Fernández Avilés (presid.), Ignacio Lizasoain Hernández (secret.), Francisco Zaragoza García (voc.), Antonio García García (voc.), Francisco Javier Díez Guerra (voc.)
• Materias:
  • Ciencias médicas
    • Farmacología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense (pdf)
• Resumen

  • El síndrome de Brugada (SBr) es una canalopatía caracterizada por la elevación del ST de las derivaciones precordiales derechas en el ECG y la predisposición a presentar arritmias y muerte súbita. Hasta un 30% de los pacientes genotipados tienen una mutación en el gen SCN5A, que codifica para el canal Nav1.5 cardiaco, responsable de la corriente rápida de entrada de Na (INa). Estas mutaciones codifican canales que producen la disminución de la INa (déficit de función). La INa determina la excitabilidad y la conducción cardiacas. Por otro lado, la corriente de potasio con rectificación interna (IK1) determina el periodo refractario y el potencial de reposo. La IK1 cardiaca humana es generada por canales Kir2.x que están distribuidos diferencialmente entre aurícula y ventrículo. Recientemente se ha demostrado que existe una modulación recíproca positiva entre los canales Nav1.5 y Kir2.1. Así, el aumento en la expresión de Kir2.1 produce un aumento en la expresión de Nav1.5 y viceversa. En el momento actual se desconoce qué ocurre con la expresión de canales Kir2.x, y por tanto con la IK1, en pacientes con mutaciones en SCN5A que generan canales con déficit de función. Por tanto, nuestro objetivo fue analizar los efectos de las mutaciones de los canales Nav1.5 asociadas a SBr sobre el tráfico de canales Kir2.x, el potencial de reposo, y la duración de los potenciales de acción, e identificar el mecanismo subyacente.Los experimentos de inmunofluorescencia demostraron que los canales Kir2.1 y Nav1.5 interaccionan en membrana lateral y en las crestas de los miocitos ventriculares de rata. En ratones transgénicos SCN5A+/--KCNJ2OE+/-, la sobreexpresión de Kir2.1 (KCNJ2OE+/-) compensa la inhibición de Nav1.5 (SCN5A+/-) y genera corrientes IK1 e INa similares a las de ratones WT. Posteriormente analizamos el efecto de los mutantes del canal Nav1.5 sobre la IK1 en células CHO, en miocitos ventriculares de rata, y en miocitos derivados de hiPSC mediante la técnica de patch-clamp. Aquellos mutantes del canal Nav1.5 que no alcanzan la membrana (p.D1690N, p.G1748D y p.D1816VfsX7) no modularon positivamente la IK1. Más aún, los mutantes, retenidos en Golgi, (p.G1748D y p.D1816VfsX7) producían una disminución adicional de la IK1 ya que el canal Nav1.5 mutado ¿atrapa¿ a canales Kir2.1 nativos, es decir producen un efecto dominante negativo (EDN). Estos resultados se comprobaron en miocitos de rata y en hiPSC-CM infectados con construcciones adenovirales que codificaban dichos mutantes. Para estudiar si ambos canales viajan juntos a membrana, recurrimos a la técnica FRAP que demostró que cuando Nav1.5 y Kir2.1 se expresan conjuntamente se forma un complejo Kir2.1-Nav1.5 con características de difusión propias distintas a la de los canales por separado. Para caracterizar el mecanismo de tráfico conjunto, incubamos células CHO con BFA, que inhibe el tráfico de retículo (RE) a Golgi. La incubación con BFA no suprimió la modulación recíproca, indicando que los complejos Kir2.1-Nav1.5 trafican por una ruta alternativa independiente de Golgi. Para estudiar esta ruta, silenciamos la proteína GRASP, responsable del tráfico de ciertas proteínas del RE a membrana sin pasar por el Golgi. En estas condiciones, se abolía la modulación recíproca positiva entre canales Kir2.1 y Nav1.5, indicando que los canales juntos trafican por una ruta no convencional GRASP-dependiente.En conclusión, los mutantes de Nav1.5 con defecto de tráfico retenidos en Golgi producen EDN sobre canales Kir2.1, produciendo una disminución adicional de la IK1. Contrariamente, los mutantes de Nav1.5 retenidos en RE pueden ser parcialmente rescatados por canales Kir2.1 a través de una ruta no convencional GRASP-dependiente. Por tanto, en los síndromes arritmogénicos en los que mutaciones en el gen SCN5A producen una disminución de la INa por el incorrecto tráfico de Nav1.5, la excitabilidad y la velocidad de conducción cardiacas disminuirán por la inhibición concurrente de la INa y la IK1