Caracterización fenotípica y funcional de células mesenquimales para regeneración condral en enfermedades osteomusculares
- Autores: Elena Alegre Aguaron
- Directores de la Tesis: María José Martínez Lorenzo (dir. tes.), Luis Larrad Mur (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Damián García Olmo (presid.), M. Pilar Lasierra Díaz (secret.), Felicito García Álvarez Álvarez (voc.), Augusto Silva González (voc.), L. Callen Sevilla (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Los primeros estudios con células madre se realizaron a finales de los años 50 utilizando células madre hematopoyéticas (McCulloch y Till, 1960). En los últimos años se ha producido un impulso notable, que ha dado lugar a lo que hoy se conoce como medicina regenerativa (Verfaillie et al., 2002), poniendo de manifiesto el potencial terapéutico de las células madre, especialmente de las células madre adultas que derivan de alguno de los tejidos adultos, (Horwitz et al., 1999; Reyes et al., 2001).
Por otro lado, las células madre embrionarias (ESCs) son capaces de proliferar indefinidamente, sin diferenciarse cuando son cultivadas in vitro. (Desbaillets et al., 2000). Sin embargo, su uso a nivel terapéutico presenta algunas limitaciones como la formación de teratomas o teratocarcinomas, consecuencia de su alta tasa de proliferación.
De esta forma, las células madre adultas, definidas clásicamente como células cuya capacidad de proliferación y diferenciación está más limitada que la de las ESCs puesto que, a priori, sólo son capaces de dar lugar a células de la capa embrionaria de la cual derivan, parecen la alternativa más segura y prometedora en el campo de la medicina regenerativa. Las células madre adultas se encuentran en muchos tejidos como: hematopoyético (Spangrude et al., 1988), sistema nervioso central (García-Verdugo et al, 1989), músculo esquelético (Jackson et al., 1999), epidérmico (Watt et al, 1988), músculo cardiaco (Hierlihy et al, 2002), hepático (Bonner-Weir et al., 2002) o adiposo (Zuk et al., 2001).
Un tipo de células madre adultas son las células mesenquimales (MSCs) cuyo estudio y caracterización representan el núcleo de esta tesis doctoral. Las MSCs fueron descritas por primera vez por Friedenstein y col. (Friedenstein et al., 1970), informándose de la existencia de células estromales con capacidad clonogénica. Son células multipotentes (Weissman et al., 2001) que cuando son cultivadas in vitro crecen adheridas a la superficie del plástico del frasco de cultivo, adquiriendo una morfología fibroblástica. Fueron las primeras células no hematopoyéticas que se aislaron de la médula ósea y en los últimos años han sido descritos algunos marcadores que permiten aislar e identificar las MSCs como CD44, CD71, CD90 (Thy-1), CD105 (SH2), CD73 (SH3 y SH4) y CD166 entre otros. Por otro lado, las células mesenquimales no expresan marcadores específicos de células hematopoyéticas como CD14, CD34 y CD45 (Pittenger et al., 1999). Sin embargo, todavía no existe un consenso acerca de un marcador único de MSCs (Pittenger et al., 2004). Por esta razón, la caracterización fenotípica de células mesenquimales constituyó uno de nuestros objetivos prioritarios.
Las células mesenquimales, además de la médula ósea, pueden aislarse de tejido adiposo (Zuk et al., 2001), sangre periférica (Zvaifler et al., 2000), cordón umbilical (Lee et al., 2004) y tejido sinovial (De Bari et al., 2001). Son células que derivan del mesodermo y, por tanto, capaces de diferenciarse a tejidos mesodérmicos como osteoblastos, condrocitos, adipocitos o mioblastos (Pittenger et al., 2000). Por estas razones, las células mesenquimales constituyen un modelo muy útil en aplicaciones clínicas para algunas enfermedades, tanto en terapia regenerativa como en terapia génica (Deans et al., 2000). La fuente habitual de obtención de MSCs ha sido siempre la médula ósea, sin embargo, dicha obtención es compleja y por ello, se han buscado fuentes alternativas, como las mencionadas anteriormente. Este es el caso del tejido adiposo, cuya obtención supone el uso de técnicas menos invasivas y además la cantidad de muestra obtenida es mayor. Lo mismo sucede con el líquido sinovial. Las MSCs del líquido sinovial pueden obtenerse sin daño para la articulación y expandirse in vitro durante muchos pases con un fenotipo estable (Djouad et al., 2005).
Una de las patologías donde las células mesenquimales pueden tener un uso terapéutico son las enfermedades osteomusculares, las cuales son clave en la regeneración del cartílago. Algunas de estas enfermedades donde las células mesenquimales podrían tener gran aplicación terapéutica son: la artritis reumatoide, la artrosis o la osteocondritis disecante. La utilización de células mesenquimales para la regeneración de cartílago articular en este tipo de enfermedades es importante puesto que se trata de un material biológico con propiedades biomecánicas específicas que hacen difícil su reemplazamiento (Ito et al., 2001). Además, el cartílago de las articulaciones adultas tiene una capacidad de regeneración limitada de forma espontánea, lo que supone un factor de riesgo que acaba produciendo la artrosis de la articulación. Por ello, nos planteamos trabajar con muestras de tejido procedentes de pacientes con artrosis y así, analizar la capacidad de diferenciación condrogénica de las células aisladas.
Uno de los métodos para la regeneración del cartílago es el trasplante de condrocitos autólogos (ACT), basado en la expansión in vitro de células obtenidas de pequeñas biopsias de cartílago (Britterg, 1994). Esta terapia celular se ha utilizado para tratar la osteocondritis disecante aunque los resultados no han sido del todo prometedores (Hunziker et al., 2002), lo que quizá sea debido a que la obtención de condrocitos del tejido es difícil, se pierden marcadores específicos de cartílago durante el proceso de expansión in vitro y se forma fibrocartílago lo que supone una pérdida de las propiedades biológicas y mecánicas del tejido. Sin embargo, existen ejemplos donde el uso de células mesenquimales consigue la diferenciación hacia condrocitos como en el estudio de Erikson et al., donde se implantaron de forma subcutánea células MSCs en ratones inmunodeficientes y se comprobó mediante inmunohistoquímica que, efectivamente, se había producido matriz cartilaginosa (Erickson, 2002). Tras realizar la caracterización celular in vitro, el siguiente paso sería la implantación de las células en un modelo animal. Por ello, nos planteamos realizar una comparación del fenotipo y la capacidad de diferenciación condrogénica de células mesenquimales de tejido adiposo de origen animal (conejo y oveja) con células mesenquimales humanas.
Por tanto, las células mesenquimales constituyen una prometedora alternativa en la terapia celular de enfermedades osteomusculares para la regeneración del cartílago dañado, sobre todo para aquellas personas que se ven obligadas a someterse a una intervención quirúrgica para el reemplazamiento de una articulación. El objetivo último que se pretendía alcanzar, era la obtención de células mesenquimales perfectamente aisladas y caracterizadas tanto fenotípica como funcionalmente, con el propósito de utilizarlas para la reparación de cartílago en enfermedades osteomusculares. Asimismo, se ha descrito que las células mesenquimales no inducen rechazo inmunológico, ya que no expresan HLA-DR (Dominici et al., 2006) en su superficie, por lo que, se podrían obtener células de muestras de distintos donantes, expandirlas in vitro y congelarlas para su uso cuando fuera necesario.
Para la consecución de este trabajo, la parte experimental se dividió en cuatro apartados: células mesenquimales de tejido adiposo procedente de diferentes especies, células mesenquimales humanas procedentes de diferentes tejidos, células aisladas de cartílago articular humano y células mesenquimales humanas de líquido sinovial procedente de pacientes con distinta patología osteoarticular.
El primer apartado se basó en la caracterización fenotípica y funcional de células mesenquimales de tejido adiposo humano, de conejo y oveja. Los resultados derivados del primer apartado revelaron que el número de células obtenidas por gramo de tejido adiposo presentó importantes diferencias entre las tres especies objeto de estudio. El mayor número de células por gramo de grasa al inicio se obtuvo a partir de tejido adiposo humano, consiguiéndose prácticamente el mismo valor en el caso de tejido adiposo de conejo. A pase 0 observamos que las células de conejo crecieron más rápido que las células de oveja y humano. El potencial de proliferación, en general, fue mayor en células de conejo y oveja a lo largo de los pases.
En cuanto al estudio fenotípico, las células humanas fueron negativas para CD31, marcador de células endoteliales, y las células de oveja lo expresaron ligeramente, en un 13%. Sin embargo, las células de conejo y oveja fueron negativas para CD34, marcador hematopoyético, y para CD36, marcador de adipocitos, mientras que las células humanas los expresaron en un 13 y 23%, respectivamente. La expresión de CD36 en las células humanas desapareció a lo largo del tiempo en cultivo. La expresión de CD117 o c-kit varió, entre las diferentes especies, desde la ausencia de expresión en humano hasta el 86% en oveja. CD133/1, otro marcador hematopoyético, se expresó en un 13% de las células de conejo analizadas. Si nos fijamos en HLA-DR expresado en células presentadoras de antígeno, su expresión fue baja aunque ligeramente superior en células de oveja.
Por otro lado, el porcentaje de células que expresaron CD13, CD44 (receptor del ácido hialurónico), CD59, CD90 y CD166 (ALCAM) a pase 1 fue detectado con variabilidad dependiendo de la especie analizada. Todos estos marcadores se expresaron en más de un 95% en las células humanas. La expresión fue muy similar para las células de oveja. Sin embargo, las células de conejo, los expresaron en porcentajes inferiores. También analizamos la expresión de CD54 (ICAM-1), observándose la mayor expresión, un 86%, en células de oveja. La expresión de CD105 fue muy alta, un 95%, en células mesenquimales humanas. El receptor de la transferrina, CD71, y CD73 se expresaron en un 76% y un 99%, respectivamente, en los cultivos humanos a pase 1, mientras que en las células aisladas de tejido adiposo de conejo y oveja, apenas se detectó expresión de estos marcadores. A pase 10, en las células humanas, la expresión de CD73 siguió siendo elevada, mientras que la de CD71 prácticamente desapareció.
En cuanto a la expresión de CD49d (integrina ¿4), observamos que la población positiva para este marcador fue mayor en el caso de las células humanas, mientras que el porcentaje de células positivas para CD49f (integrina ¿6) alcanzó el 84% en células de conejo, disminuyendo de forma importante en las células de oveja de pase 1 a pase 10. La expresión de CD106 (VCAM-1) fue muy baja, ya que aunque se expresó en mayor medida en células de oveja a pase 1, se negativizó a partir de pase 2.
Las células mesenquimales de tejido adiposo de conejo y oveja mostraron un gran potencial condrogénico. De hecho, mantuvieron ese potencial hasta pases de cultivo más avanzados. Por el contrario, las muestras obtenidas a partir de la diferenciación in vitro de células humanas a pase 1, mostraron valores más bajos, presentando una débil tinción y una densidad celular con una puntuación moderada. La morfología celular fue redondeada en todos los casos. Por ello, la puntuación para este parámetro en la escala de Bern Score fue la máxima.
En el segundo apartado se pretendían aislar y caracterizar células mesenquimales humanas de médula ósea, grasa de Hoffa, grasa subcutánea y líquido sinovial, con el fin de hallar células mesenquimales con el mismo potencial que las de médula ósea. Respecto al apartado anterior, se amplió el estudio con un número mayor de muestras de origen humano, que fueron extraídas, en todos los casos, de la rodilla de los pacientes intervenidos. Para el análisis estadístico, se compararon todos los resultados obtenidos por las células mesenquimales de grasa y líquido sinovial con los de médula ósea, por ser la fuente clásica de obtención de células mesenquimales.
El número total de células por mililitro, obtenido a lo largo de los pases, fue más bajo en las células de líquido sinovial y significativamente mayor en las células de grasa subcutánea a pase 0 y 1.
Las células de los distintos tejidos fueron negativas para CD31, marcador de células endoteliales, CD117, CD133/1, marcadores hematopoyéticos, y HLA-DR, marcador de células presentadoras de antígeno. Asimismo, fueron positivas para CD13, CD44, CD49c, CD59, CD73, CD90, CD105 (definidos como marcadores de células mesenquimales por la Sociedad Internacional de Terapia Celular), CD166 y para CD140b y CD151, expresados también en condrocitos. CD34 se expresó en un 17% de la población de células de grasa analizada. La expresión de CD36, marcador de adipocitos, fue muy baja, excepto en células de grasa subcutánea que alcanzaron un 27%. Por otro lado, los niveles de expresión de CD271, descrito como marcador de algunas subpoblaciones de células mesenquimales, fueron bajos. CD340, también descrito como marcador de células mesenquimales de médula ósea, se expresó en porcentajes similares, superiores al 80%, en células derivadas de médula ósea y grasa de Hoffa. La expresión del antígeno de células mesenquimales-1 (MSCA-1) fue superior al 80% en células de tejido adiposo. Como ya describieron otros grupos, la expresión de CD49d fue mayor en células mesenquimales de tejido adiposo, mientras que las células de médula ósea expresaron un mayor porcentaje de CD106 que las de tejido adiposo. El porcentaje de expresión del receptor de la transferrina, lo mismo que el de CD49d, fue mayor en las células de grasa.
Las muestras obtenidas a partir de la diferenciación de células derivadas de médula ósea, mostraron una gran capacidad de diferenciación condrogénica in vitro, tanto a pase 1 como a pase 3. En las muestras obtenidas a partir de células de grasa de Hoffa observamos que la morfología y la densidad celular obtuvieron unas puntuaciones próximas a 3, mientras que la puntuación para la tinción con Safranina-O fue moderada a pase 1 y más débil a pase 3. La puntuación de las muestras de diferenciación condrogénica in vitro a partir de las células derivadas de grasa subcutánea fue mucho menor, ya que no se teñían con Safranina-O y las células eran alargadas, con una morfología fusiforme. En el caso de las muestras obtenidas a partir de células de líquido sinovial la puntuación final obtenida fue menor que en las de médula ósea y grasa de Hoffa. La menor puntuación se obtuvo en cuanto a la tinción con Safranina-O.
En el estudio de las citoquinas presentes en el medio de cultivo de las células mesenquimales, las concentraciones de IL-6 e IL-8 fueron las únicas donde se observaron valores por encima de 250 pg/ml. La menor concentración de IL-6 se registró en los sobrenadantes de los cultivos de células de líquido sinovial. La concentración de IL-8 fue más baja que la de IL-6 y la del resto de citoquinas fue casi indetectable.
En el tercer apartado se evaluó la influencia del método de aislamiento (colagenasa A o colagenasa IV) y el medio de cultivo (medio de células mesenquimales o medio de condrocitos) en células aisladas de cartílago articular humano. Las muestras se obtuvieron de regiones sanas del cóndilo femoral, durante el transcurso de las artroplastias de rodilla. Los resultados estadísticos se refirieron a las células aisladas con colagenasa A y cultivadas en medio M, que son las mismas condiciones utilizadas para el aislamiento de células mesenquimales de apartados anteriores.
El número de células obtenidas al inicio por gramo de cartílago fue ligeramente superior cuando se utilizó colagenasa IV. De pase 1 a pase 3, el número de células por mililitro en los distintos cultivos fue bastante variable, siendo, en general, mayor para las células aisladas con colagenasa IV y cultivadas en medio M.
Así, las células aisladas de cartílago articular fueron negativas para CD31, CD34, CD36, CD117, CD133/1 y HLA-DR y positivas para CD13, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105, CD151 y CD166, de manera similar a lo descrito en células mesenquimales. La expresión de CD49c (integrina ¿3) fue mayor del 85% para las células cultivadas en medio M. La expresión de CD49d y CD49f fue variable entre los diferentes cultivos, siendo especialmente baja en los cultivos en medio C. La expresión de CD106, CD54 y CD71, lo mismo que la expresión de CD49c, fue mayor en los cultivos en medio M. Si nos fijamos en la expresión de CD140b y CD340, observamos también una mayor expresión en los cultivos en medio M. CD56, descrito recientemente como un marcador de una pequeña subpoblación de células madre de médula ósea con potencial condrogénico, sólo se expresó en las células crecidas en medio M, sin alcanzar el 40% de expresión. No se observó expresión de CD271 en estas células y para MSCA-1 los niveles de expresión fueron ligeramente superiores en las células crecidas en medio M, alcanzando el 55% de expresión.
Todas las muestras obtenidas a partir de la diferenciación de células aisladas de cartílago articular en el medio de diferenciación condrogénico tuvieron una puntuación mínima de 7,5. Cabe destacar que de los tres parámetros evaluados, la morfología celular fue redondeada obteniendo, prácticamente en todos los casos, la puntuación máxima para ese parámetro.
En los medios M de cultivo de células aisladas de cartílago articular humano, la mayor concentración de citoquinas se encontró para las interleuquinas 6 y 8 (citoquinas pro-inflamatorias) tanto a pase 1 como a pase 3. La concentración de IL-6 observada fue menor que en los sobrenadantes de células mesenquimales de médula ósea a pase 1 y pase 3 del apartado anterior. Por el contrario, la concentración de IL-8 a pase 3 fue mayor que la de los cultivos de células mesenquimales de los distintos tejidos analizados. En general, el resto de citoquinas tuvieron concentraciones en el rango de las concentraciones obtenidas en los sobrenadantes de células mesenquimales.
En el último apartado se quería estudiar la influencia de distintas patologías osteoarticulares en células mesenquimales. Para ello, se caracterizaron células mesenquimales aisladas de líquido sinovial de pacientes con artrosis, artritis reumatoide o artritis gotosa Las células mesenquimales derivadas de líquido sinovial, independientemente de que los pacientes sufriesen artrosis, artritis reumatoide o artritis gotosa fueron negativas para CD31, CD34, CD36, CD117, CD133/1, HLA-DR y CD271 y positivas para CD13, CD44, CD49c, CD59, CD73, CD90, CD105, CD151 y CD166. Sin embargo, en el caso de CD49d y CD49f la expresión fue mayor del 70% cuando los líquidos sinoviales procedían de pacientes con artrosis. El porcentaje de expresión de CD106 fue mayor en células derivadas de líquido sinovial de pacientes con artrosis pero, en este caso, con un porcentaje de expresión relativamente bajo, menor del 25%. Por tanto, el fenotipo fue similar independientemente de la patología de los pacientes.
Las muestras de diferenciación condrogénica in vitro a partir de células mesenquimales de líquido sinovial de pacientes con artrosis a pase 1, obtuvieron una puntuación final ligeramente superior. En todos los casos, la valoración más baja se obtuvo para el primero de los parámetros, que hace referencia a la fuerza de la tinción con Safranina-O.
Tras los resultados obtenidos en los distintos apartados, se pueden extraer las conclusiones que se exponen a continuación: 1.- Las células mesenquimales de tejido adiposo de conejo y oveja, tienen un mayor potencial de proliferación y una mayor capacidad condrogénica in vitro que las células humanas. La expresión de algunos marcadores (CD44, CD54, CD90 o CD166), en células mesenquimales de origen animal y células mesenquimales humanas, es distinta. En algunos casos, como CD71, la diferencia de expresión entre las tres especies estudiadas, desaparece a lo largo de los pases de cultivo. En otros casos, como CD73 y CD105, las diferencias se mantienen aunque no influyen en la capacidad de diferenciación condrogénica in vitro. El estudio con células mesenquimales derivadas de tejido adiposo de distintas especies (conejo, oveja y humano), ayudará a la interpretación de los estudios in vivo en modelos animales (Martínez-Lorenzo et al., 2009).
2.- Las células mesenquimales aisladas de grasa de Hoffa proliferan más rápido que las aisladas de médula ósea. Además, tienen un patrón de marcadores de superficie y una capacidad de diferenciación condrogénica in vitro, similar a las de médula ósea.
3.- Las células de grasa subcutánea obtenidas de rodilla, no parecen ser una buena alternativa a la médula ósea, puesto que las MSCs derivadas de este tejido no presentan una buena capacidad de diferenciación condrogénica in vitro debido, quizá, a la expresión diferencial de marcadores como CD36 o CD54.
4.- Las células mesenquimales de líquido sinovial proliferan menos y además, tienen peor capacidad de diferenciación condrogénica in vitro que las de grasa de Hoffa y médula ósea. Esto indica que de los distintos tejidos estudiados como fuentes alternativas a la médula ósea, la grasa de Hoffa parece ser la mejor opción.
5.- Las células aisladas de cartílago articular se revelan como una fuente de obtención de células para regeneración condral de forma autóloga en pacientes afectados de artrosis, puesto que la morfología, el fenotipo, la capacidad de diferenciación condrogénica in vitro y la expresión de citoquinas son similares a las mostradas por células mesenquimales humanas de médula ósea y grasa de Hoffa.
6.- Independientemente de la colagenasa utilizada para su aislamiento, las células de cartílago cultivadas en medio M muestran un perfil fenotípico más parecido al perfil mostrado por células mesenquimales humanas, con mayor expresión de algunos marcadores como CD49c, CD106, CD140b, CD340, respecto a las cultivadas en medio C.
7.- El tipo de colagenasa utilizada para el aislamiento de células de cartílago, el medio de cultivo y el tiempo en cultivo, no influyen en la capacidad de diferenciación condrogénica in vitro de las células aisladas de cartílago articular.
8.- En pacientes con artrosis, la edad no influye en la capacidad de diferenciación in vitro hacia cartílago de células mesenquimales de distintos tejidos (médula ósea, grasa de Hoffa y líquido sinovial) y de células aisladas de cartílago articular humano.
9.- Las células mesenquimales humanas, independientemente del tejido del que se aíslan, y células aisladas de cartílago articular humano, liberan mayoritariamente IL-6 (citoquina pro-inflamatoria), aunque su liberación no inhibe la diferenciación condrogénica in vitro de estas células.
10.- La morfología y el fenotipo de células mesenquimales de líquido sinovial de pacientes con artrosis, artritis reumatoide o artritis aguda, es similar al de células mesenquimales humanas de médula ósea y tejido adiposo de pacientes con artrosis. Su potencial de proliferación celular y de diferenciación in vitro hacia linaje condroide es menor que el de células mesenquimales de médula ósea y grasa de Hoffa de pacientes con artrosis.
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