Estudios estructura-función sobre la enzima aril-alcohol oxidasa implicada en la biodegradación de la lignina
- Autores: Patricia Ferreira Neila
- Directores de la Tesis: Ángel Tomás Martínez Ferrer (dir. tes.), Juan Soliveri de Carranza (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2004
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Bartolomé Sabater García (presid.), José Luis Copa Patiño (secret.), Carlos Gómez-Moreno Calera (voc.), Miguel Ángel Falcón Sanabria (voc.), Guillermo Giménez Gallego (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: e_Buah
- Resumen
La biodegradación de la lignina es un proceso oxidativo, llevado a cabo por los denominados hongos de podredumbre blanca. El peróxido de hidrogeno tiene un importante papel en este proceso como precursor del radical libre hidroxilo y co-sustrato de peroxidasas ligninolíticas. La aril-alcohol oxidasa (AAO) de Pleurotus eryngii es una flavoproteína extracelular que genera H2O2 en la reacción de oxidación de la enzima por el O2, mientras que su reducción da lugar a reacciones de oxidación y deshidrogenación de diferentes alcoholes aromáticos. Su reciente clonación y expresión heteróloga en Emericella nidulans y Escherichia coli ha permitido completar la caracterización fisicoquímica, cinética y estructural de la AAO.
Los estudios de especificidad de sustrato pusieron de manifiesto que los sustratos típicos de la AAO son alcoholes aromáticos o alifáticos poliinsaturados con un hidroxilo primario en el Ca. Además los estudios de inhibición revelaron que la AAO tiene afinidad por compuestos con sistemas de dobles enlaces conjugados con o sin grupos hidroxilo alcohólicos. Los estudios de cinética rápida con diferentes alcoholes pusieron de manifiesto la dependencia de las cinéticas de reducción de la AAO del tipo sustrato.
La AAO presenta una moderada homología de secuencia con la glucosa oxidasa de Aspergillus niger lo que permitió su modelado por homología (entrada PDB 1QJN). La comparación de la estructura primaria de la AAO con la glucosa oxidasa y otros miembros de la familia GMC de oxido-reductasas, reveló la existencia en la secuencia de la AAO de los cuatro motivos conservados en esta familia. Este hecho, junto con las similares características estructurales encontradas, han llevado en este trabajo a incluir a la AAO de P. eryngii como un nuevo miembro de la familia GMC. La arquitectura molecular general de la AAO presenta dos dominios estructurales: i) dominio de unión del FAD y ii) dominio de unión al sustrato. En este último se ha identificado un canal de acceso al centro activo de naturaleza fundamentalmente hidrofóbica y de características similares al observado en otras oxidasas como la glucosa oxidasa. En los estudios de acoplamiento molecular de la AAO con distintos sustratos se observó que éstos se localizaban en las inmediaciones del cofactor, pudiendo describirse un bolsillo de unión de los sustratos. Posteriores estudios de mutagenesis dirigida confirmaron el papel de alguno de los residuos del centro activo de la AAO en la actividad catalítica de la enzima. Estos estudios mostraron la necesidad de un residuo aromático en las posiciones ocupadas por Y92 y F501, ya que la actividad de la AAO se mantuvo tras las sustituciones F)Y o Y-F. Las constantes cinéticas de las variantes obtenidas sugieren que ambos residuos podrían modular el potencial redox del FAD, y Y92 podría también contribuir a la adecuada orientación de los sustratos.
Simultáneamente se mostró que dos histidinas próximas al N5 del anillo de flavina (H502 y H546) y a la probable localización del hidroxilo del sustrato, son indispensables para la actividad catalítica (tal como se vio al sustituirlas por residuos de serma, leucina o arginina). Se propone que estas dos histidinas, altamente conservadas en la familia GMC de oxidorreductasas, actuarían como bases activas en la reacción de oxidación de ios sustratos, a través de un mecanismo de deshidrogenación por transferencia directa de un hidruro y reducción del FAD.
