Resumen de Ingeniería tisular: aplicación de células madre en reparación de defectos epidérmicos
- español
Una adecuada cicatrización de las heridas de la piel es clave en el desarrollo favorable de numerosos cuadros patológicos. Se han descrito un gran número de complicaciones médicas o quirúrgicas que pueden ser atribuidas a deficiencias en la cicatrización de las heridas, existiendo un amplio abanico de enfermedades y entidades patológicas (insuficiencia venosa periférica, isquemia arterial, diabetes, cáncer, inmunodepresión), que influyen de forma negativa sobre la reparación de las heridas, siendo la causa de una parte importante de la morbilidad e indirectamente, de la mortalidad, que encontramos a nivel hospitalario. Mención especial merecen por su frecuencia y por el gran impacto sanitario y socioeconómico que acarrean sus potenciales secuelas, las úlceras por decúbito y/o vasculares.
La ingeniería tisular, se ha visto enriquecida en los últimos años por la aparición continua de numerosos estudios que intentan aportar más luz sobre la biología de las células madre y sus posibles aplicaciones terapéuticas.
Como hipótesis de trabajo, nos planteamos, si las células madre musculares (muscle derived stem celis, MDSC) podían representar una alternativa eficaz para la reparación de defectos cutáneos excisionales. Para verificar esta hipótesis, nos propusimos dos objetivos: - Aislamiento, caracterización y elección del momento para el transplante de las MDSC.
- Aplicación de las MDSC como terapia celular sobre un modelo experimental de defecto excisional cutáneo.
En el primer objetivo se diseñó un protocolo de obtención de MDSC. Las células fueron extraídas a partir de una biopsia del músculo dorsal de conejos blancos de Nueva Zelanda (n=20), y se llevó a cabo su caracterización mediante técnicas inmunohistoquímicas y de Western blot. Se realizaron ensayos de proliferación con 3H-Timidina y estudios de microscopia óptica y electrónica de transmisión y barrido. Los resultados obtenidos confirmaban que tras 14 días en cultivo, la población celular se compone principalmente de células precursoras, con capacidad de proliferación, adhesión y migración, lo cual recapitulaba propiedes biológicas, para la aplicación de las mismas en el modelo experimental de cicatrización diseñado en el segundo objetivo, donde se realizó un defecto excisional cutáneo de 2 cm de diámetro en cada una de las orejas del animal de experimentación. Los defectos se realizaron en la cara dorsal de ambas orejas de animal con un dispositivo rígido, cilíndrico y cortante. Se respetó el tejido correspondiente al pericóndrio del cartílago de la oreja. El sacrificio de los animales se realizó a los 14 días, estableciéndose dos grupos de estudio: grupo I - control (oreja izquierda), (n=10); defectos sin tratamiento, y grupo II (n=10), defectos que fueron tratados con transplante de células madre autólogas (MDSC) (oreja derecha). La población celular, fue marcada con PKH-26 para su seguimiento dentro del defecto. Las heridas se protegieron con una cubierta de polietileno de diseño propio. A continuación, se colocó un collarín alrededor del cuello del animal para evitar que éste manipulara las heridas con sus extremidades.
A nivel macroscópico, los defectos creados fueron evaluados en cuanto a los fenómenos de contracción y recubrimiento. Las áreas de contracción y reepitelización se estudiaron por histomorfometría. Los estudios morfométricos fueron realizados mediante técnicas de análisis de imagen. Para el estudio estadístico se empleó el test de la U de Mann.Whitney.
Los estudios histológicos fueron realizados empleando técnicas de microscopia óptica y electrónica de transmisión y barrido e inmunohistoquímicos.
Los resultados morfométricos, muestran que el fenómeno de contracción fue significativamente superior en el grupo control que en el tratado (1.83 cm2 vs 2.72 cm2); *p<0.05). Expresado en porcentaje de contracción obsevamos un 50.83+- 12.84 % en el grupo control frente a un 22.25+- 9.56% en el grupo sometido a terapia celular. El área de reepitelización fue significativamente mayor en el grupo tratado que en el grupo control (2.50 cm2 vs 1.29 cm2; *p<0.05). Los respectivos porcentajes de las áreas reepitelizadas fueron de 96.33+- 3.09 % vs 70.91+- 6.94%.
La microscopia óptica mostró como el proceso cicatricial en las heridas control, avanza a partir de los bordes sanos cel defecto. En este proceso encontramos con frecuencia en las áreas más superficiales, células blancas, células de características epiteliales y yemas vasculares. La tinción rojo sirio para la detección de colágeno, reveló la presencia de colágeno tipo III en los defectos control y de colágeno tipo I o maduro en las orejas sembradas. En estos defectos el trazador PKH-26, permitió observar su evolución dentro de la herida. En presencia del sustrato sembrado se observó una superficie continua entre los bordes del defecto. Este sustrato favorece la proliferación y migración de las células desde los bordes sanos. Los queratinocitos proliferaban sobre dicho sustrato y de forma centrípeta, hacia el centro del defecto.
El estudio inmunohistoquímico realizado sobre las muestras control y las sometidas a terapia celular, reveló en ambos casos una ausencia de expresión para vimentina y desmina, mientras que la expresión para o-actina, se localizaba sobre los vasos nativos en los dos grupos de estudio. La expresión de miosina en las muestras control fue mayor que en las heridas tratadas, posiblemente correspondientes a zonas de mayor presencia de miofibroblastos y consecuentemente a áreas de contracción.
Los resultados obtenidos nos permiten formular las siguientes conclusiones:
1.- La población aislada a partir de músculo esquelético, posee las propiedades inherentes a una población de células diferenciales y con gran capacidad de proliferación y autorrenovación como lo demuestran los resultados comparados con la población de fibroblastos utilizados como control de células diferenciadas.
2.- Tras 14 días de cultivo, la población de MDSC es indiferenciada, proliferativa y muy adherente, por lo que consideramos que son características idóneas para ser transplantadas como terapia celulas sobre un defecto cutáneo excisional.
3.- Los defectos sometidos a terapia celular durante dos semanas, mostraron una significativa disminución del área de contracción del defecto creado, así como una significativa aceleración de la reepitelización con respecto al grupo sin tratamiento alguno.
Las conclusiones anteriores, nos permiten elevar nuestra hipótesis a categoría de tesis y afirmar que: Las células derivadas de células musculares indiferenciadas MDSC aisladas por nosotros y tras 14 días de cultivo, cumplen los requisitos exigidos para su uso como terapia celular, tanto en número como características de adhesión, proliferación y diferenciación.
- English
Wound healing is a key step in the process whereby a patient’s health is fully recovered. Wounds represent the loss of a physical barrier that protects tissues from invasion by microorganisms and allows the loss of fluids, which can be drastic in patients with burns. Further, several medical or surgical complications can be attributed to deficient wound healing. In the intrahospital setting, these may be a significant cause of morbidity and, indirectly, of mortality.
In regenerative medicine several areas of biomedical research merge to give rise to tissue engineering, whose basic tools are cells, scaffolds or matrices, and signals.
Interest in tissue engineering has been recently rekindled by new knowledge emerging on the biology of stem cells and their possible therapeutic applications. Previous attempts at obtaining epidermal adult stem cells capable of slow epithelialisation and stabilising the healing processes in large burns, prompted us to consider the possibility of using musclederived stem cells (MDSC) to aid the wound repair process. These cells have been used in the treatment of other diseases but never for skin repair purposes.
Our working hypothesis was whether MDSC could be an efficient option for the repair of incisional cutaneous defects. To test this hypothesis, we established two main objectives:
1) To isolate and characterise MDSC and select the best time for grafting.
2) To apply MDSC as cell therapy in an experimental incisional cutaneous wound model.
For the first objective, MDSC were harvested from a biopsy specimen taken from the dorsal muscle of New Zealand White rabbits, and then characterised by immunohistochemical techniques and Western blotting. These in vitro studies were completed with a cell proliferation assay based on 3Hthymidine incorporation. Light microscopy and transmission and scanning electron microscopy studies were also performed.
Fourteen days of culture rendered a cell population comprised mainly of precursor cells capable of proliferation, adhesion and migration, thus reproducing their biological properties for their application in the skin repair model designed as the second objective of our study.
MDSC were applied to a 2 cmdiameter incisional skin defect created on the ear of the experimental animal. The wounds were made on the back part of both ears using a cutting cylindrical instrument avoiding the perichondrial tissue of the ear cartilage.
The animals were sacrificed after 14 days and two study groups established according to whether the wounds were left untreated (Control group, left ear) (n=10) or treated with grafted autologous MDSC (Treatment group, right ear) (n=10). The cultured cells used were labelled with PKH26 so that they could be traced inside the wound. The wounds were covered with a custom made polyethylene dressing. The rabbit was fitted with a neck collar to prevent it touching the wound.
The wounds were evaluated visually in terms of wound contraction and reepithelialisation established by histomorphometry, including image analysis. Data were compared using the MannWhitney Utest.
Light and electron microscopy techniques were used for the histological studies.
Our morphometric data revealed significantly greater wound contraction in the control than treatment group (1.83 cm2 vs 2.72 cm2 ; *p<0.05). When expressed as a percentage, contraction was 50.83± 12.84% in the control group versus 22.25± 9.56 % for the cell therapy group. A significantly larger reepithelialised area was recorded for the treatment group (2.50 cm2 vs 1.29 cm2; *p<0.05). Percentage reepithelialised areas were 96.33± 3.09% vs 70.91±6.94% respectively.
Light microscopy revealed that the repair process in the control wounds commences at the healthy edges of the defect. In surface areas, white blood cells, cells with epithelial characteristics and vascular buds were often found. Sirius red showed the presence of type III collagen in control wounds and type I, or mature collagen, in the seeded wounds. The PKH26 marker allowed us to monitor the stem cells in the treated wounds. In the presence of the seeded substrate, a continuous surface appeared between the defect’s edges. The substrate promotes the proliferation and migration of the cells from the healthy margins inwards. Keratinocytes proliferate in a centripetal manner towards the center of the defect.
The immunohistochemical study performed on control and treated specimens in both cases revealed a lack of vimentin and desmin expression, while labelling for αactin appeared on native blood vessels in both study groups. The expression of myosin in control specimens was greater than in the treated wounds and possibly corresponded to zones with more myofibroblasts and therefore to areas of wound contraction. Our findings allowed us to draw the following conclusions:
1. The cell population isolated from skeletal muscle shows several properties inherent to an undifferentiated population of cells and self renewal, as indicated by the results compared to those observed for the fibroblasts used as the differentiated cell control.
2. After 14 days of culture, the MDSC are undifferentiated, proliferative and very adherent. These are ideal properties for their application in the repair of incisional skin defects.
3. Wounds subjected to cell therapy for two weeks experienced significant less contraction of the defect’s area as well as a significantly faster reepithelialisation than the control untreated wounds. .
Thus, isolated undifferentiated MDSC cultured for 14 days fulfill all the requirements for their use as cell therapy, both in terms of numbers and adhesion, proliferation and differentiation properties. In an experimental model, the repair of an incisional wound was significantly improved.
